球孢白僵菌菌株Ｂｂ－２孢子侵染力和代謝產(chǎn)物毒力

高萍 胡強 王彭

摘要：利用球孢白僵菌菌株Ｂｂ－２（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ Ｂｂ－２）活體孢子和代謝產(chǎn)物對２齡小菜蛾（Ｐｌｕｔeｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）幼蟲和桃蚜（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）進行毒力測定。結(jié)果表明，菌株Ｂｂ－２在１．１×１０７、１．１×１０８、１．１×１０９個孢子／ｍＬ ３個濃度下，對２齡小菜蛾幼蟲和桃蚜均表現(xiàn)出較高的侵染力。在高濃度（１．１×１０９個孢子／ｍＬ）條件下，２齡小菜蛾幼蟲的４ ｄ累計死亡率為７５.0％，桃蚜的４ ｄ累計死亡率為９２．５％。在低濃度（１．１×１０７個孢子／ｍＬ）條件下，２齡小菜蛾幼蟲的４ ｄ累計死亡率為３６．７％，桃蚜的４ ｄ累計死亡率為４７．７％。菌株Ｂｂ－２發(fā)酵液對２齡小菜蛾幼蟲和桃蚜均有一定的活性，且對桃蚜的活性明顯高于對小菜蛾的活性。

關(guān)鍵詞：球孢白僵菌菌株Ｂｂ－２（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ Ｂｂ－２）；侵染力；代謝產(chǎn)物

中圖分類號：Ｓ４７６．１２；Ｓ４３６．３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）15－3237-03

Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｐｏｒｅｓ ａｎｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｆｉｌｔｒａｔｅｓ ｏｆ Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ Ｂｂ－２

ＧＡＯ Ｐｉｎｇ，ＨＵ Ｑｉａｎｇ，ＷＡＮＧ Ｐｅｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１６１， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ ｓｔｒａｉｎ Ｂｂ－２ ｔｏ Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ ｗａｓ ａｓｓａｙｅｄ ｂｙ ｉｔｓ ａｌｉｖｅ ｓｐｏｒｅｓ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｂｂ－２ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ａｔ ｔｈｒｅｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｉｅｓ， １．１×１０７，１．１×１０８，１．１×１０９ ind./mL． Ａｔ ｈｉｇｈ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ １．１×１０９ ind./mL， ｔｈｅ ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｏｆ Ｐ. ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ ｗａｓ ７５.0％； ａｎｄ of Ｍ. ｐｅｒｓｉｃａｅ ｗａｓ ９２．５％ in 4 d． Ａｔ ｌｏｗ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ， ｔｈｅ ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗａｓ ３６．７％； ａｎｄ of Ｍ. ｐｅｒｓｉｃａｅ ｗａｓ ４７．７％． Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅs ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｂｂ－２ ｗｅｒｅ also with anti-pest active； ａｎｄ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｍ． ｐｅｒｓｉｃａｅ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ Ｐ． ｘｙｌｏｓｔｅｌｌｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ Ｂｂ－２； ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅｓ

小菜蛾（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）和桃蚜（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）是世界性重要害蟲，由于發(fā)生廣、為害重且極易對化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性，對蔬菜生產(chǎn)造成很大的威脅。因此，微生物殺蟲劑的開發(fā)成為國內(nèi)外研究的熱點，昆蟲病原真菌也由于其獨特的殺蟲作用而日益受到關(guān)注［１］。

白僵菌（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）是當前世界上研究和應(yīng)用最廣泛的一種昆蟲病原真菌，在自然界的分布極為廣泛，寄主約有１５個目的７００多種昆蟲［２］，在國外已被成功開發(fā)成為多種劑型農(nóng)藥并登記注冊，在害蟲的可持續(xù)治理中具有重要意義［３，４］。１９９５年美國相繼注冊登記了２個真菌殺蟲劑系列產(chǎn)品，1個是球孢白僵菌，另1個是玫煙色擬青霉，用于防治蚜蟲、葉蟬等刺吸式害蟲，標志著防治刺吸式害蟲的真菌殺蟲劑產(chǎn)業(yè)化的開始［５］。而我國應(yīng)用絲孢類蟲生真菌防治刺吸式害蟲的研究尚處于起步階段。因而，加快針對刺吸式害蟲的真菌殺蟲劑的開發(fā)，是我們面臨的重要機遇和挑戰(zhàn)。本試驗對分離于桃蚜體上的球孢白僵菌Ｂｂ－２菌株對小菜蛾幼蟲和桃蚜的毒力進行了測定，為進一步研究和開發(fā)利用該菌株奠定基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１供試昆蟲與菌株

供試昆蟲：小菜蛾（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）２齡幼蟲，由沈陽化工研究院提供，并由本實驗室繼代飼養(yǎng)；桃蚜（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）無翅成蚜，采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院基地溫室，采用盆栽白菜苗室內(nèi)飼養(yǎng)。

供試菌株：球孢白僵菌Ｂｂ－２菌株，原始寄主為桃蚜，于２００６年１０月采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實驗地，經(jīng)室內(nèi)保濕，分離純化獲得。

１．２培養(yǎng)基

ＳＤＡＹ培養(yǎng)基（成分：葡萄糖２０ ｇ、蛋白胨１０ ｇ、酵母浸膏１０ ｇ、瓊脂２０ ｇ、蒸餾水１ ０００ ｍＬ。）

查氏培養(yǎng)基（成分：蔗糖３０ ｇ、ＮａＮＯ３ ２ ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ、蛋白胨５ ｇ、ＫＣｌ ０．５ ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ、ＦｅＳＯ４ ０．０１ ｇ、蒸餾水１ ０００ ｍＬ）

１．３毒力測定

１．３．１菌株Ｂｂ－２孢子侵染力測定

１）菌液的制備。將菌種Ｂｂ－２接種于ＳＤＡＹ培養(yǎng)基上，在２５ ℃培養(yǎng)１５ ｄ。用含０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０的無菌水分兩次加入試管中沖洗，用接種針輕輕刮下培養(yǎng)斜面上的孢子，倒入滅過菌的小燒杯中，然后用無菌水倍比稀釋配成１．１×１０７、１．１×１０８、１．１×１０９個孢子／ｍＬ的孢子懸浮液。

２）小菜蛾接種方法。用打孔器將新鮮的白菜葉片打成直徑５ ｃｍ左右的圓片，置于底部墊有濾紙片的培養(yǎng)皿中，每皿３片。采用浸漬法將２齡小菜蛾幼蟲處理后接入保濕的培養(yǎng)皿中，每皿３０頭。每個處理設(shè)３個重復(fù)，以浸漬含有０．１％ Ｔｗｅｅｎ－８０無菌水的處理作對照。處理后放入恒溫培養(yǎng)箱在（２５±１） ℃、相對濕度（８５±５）％條件下培養(yǎng)，每天換一次葉片，每日記錄死、活蟲數(shù)，９６ ｈ后統(tǒng)計校正死亡率。蟲死后保濕培養(yǎng)，觀察菌絲生長及產(chǎn)孢情況。并挑片鏡檢確認是否為白僵菌感染致死［６-8］。

３）桃蚜接種方法。將有蚜蟲的白菜葉片浸入孢子懸液中，浸漬３ ｓ。用吸水紙吸去多余的水分。除去死蚜蟲及過大或過小的蚜蟲，保留個體一致的活成蚜，放入保濕的培養(yǎng)皿中，用白菜葉片飼養(yǎng)。每個處理３次重復(fù)，每個重復(fù)４０頭蚜蟲，用含０．１％ Ｔｗｅｅｎ－８０的無菌水處理作對照。放入（２５±１）℃、相對濕度（８５±５）％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天定時觀察，及時將蚜尸和若蚜移出，記錄死、活蟲數(shù)，７２ ｈ后統(tǒng)計校正死亡率。蟲死后保濕培養(yǎng)，觀察菌絲生長及產(chǎn)孢情況。并挑片鏡檢確認是否為白僵菌感染致死［6-8］。

１．３．２菌株Ｂｂ－２代謝產(chǎn)物侵染力測定

１）菌株Ｂｂ－２次級代謝產(chǎn)物的制備。將菌株Ｂｂ－２接種至已滅菌的查氏培養(yǎng)基中， ２５ ℃液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)７ ｄ。發(fā)酵液抽濾出菌絲后，將發(fā)酵液置于４ ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

２）對小菜蛾的毒力測定方法。將新鮮的白菜葉片洗凈，用打孔器打成圓葉片，每一圓葉片上點一滴發(fā)酵液，與另一片未滴發(fā)酵液的葉片對貼，貼上后就不要再移動。每頭幼蟲一片夾毒葉片放在指形瓶中飼養(yǎng)，用脫脂棉封口。每個處理３０頭幼蟲，重復(fù)３次。以滴加蒸餾水的葉片為對照。處理后于培養(yǎng)箱內(nèi)在（２５±１）℃、相對濕度（８５±５）％條件下培養(yǎng)，分別于２４、４８ ｈ記錄死、活蟲數(shù)，統(tǒng)計校正死亡率。

３）對桃蚜的毒力測定方法。將有蚜蟲的白菜葉片浸入發(fā)酵液中，浸漬３ ｓ。用吸水紙吸去多余的水分。除去死蚜蟲及過大或過小的蚜蟲，保留個體一致的活成蚜，放入墊有濾紙片的培養(yǎng)皿中，用白菜葉片飼養(yǎng)。每個處理３次重復(fù)，每個重復(fù)３０頭蚜蟲。用蒸餾水處理作對照。放入（２５±１）℃、相對濕度（８５±５）％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天定時觀察，及時將蚜尸和若蚜移出，記錄死、活蟲數(shù)，統(tǒng)計校正死亡率［9］。

２結(jié)果與分析

２．１菌株Ｂｂ－２孢子侵染力測定結(jié)果

２．１．１昆蟲被侵染后的癥狀被侵染后的小菜蛾幼蟲蟲體初期蟲體膨大變色，然后變僵，之后僵蟲體外出現(xiàn)白色菌絲體，漸漸整個蟲體會被乳白色的分生孢子粉包裹。被侵染的桃蚜初期身體膨大，然后變僵硬。體表最先出現(xiàn)白色菌絲體，之后除觸角、肢體末端之外的整個蟲體被白色的粉狀物即分生孢子覆蓋。最后蟲體被菌絲體和分生孢子完全覆蓋。

２．１．２孢子侵染力測定結(jié)果在２５ ℃條件下，采用１．１×１０７、１．１×１０８、１．１×１０９個孢子／ｍＬ ３個濃度的孢子懸浮液測定菌株Ｂｂ－２對小菜蛾幼蟲和桃蚜的侵染力。根據(jù)試驗所得數(shù)據(jù)，用ＤＰＳ軟件進行統(tǒng)計分析。從圖１、圖２中可以看出，菌株Ｂｂ－２對小菜蛾幼蟲和桃蚜均表現(xiàn)出致病力，但對桃蚜的致病力要明顯高于對小菜蛾幼蟲的致病力。在高濃度（１．１×１０９個孢子／ｍＬ）條件下，小菜蛾２齡幼蟲的死亡率為７５．０％，而桃蚜的死亡率高達９２．５％；在低濃度條件下，小菜蛾２齡幼蟲的死亡率為３６．７％，桃蚜的死亡率為４７．７％。隨著接種孢子濃度的增加，菌株Ｂｂ－２對小菜蛾和桃蚜的致病力增強，但對不同昆蟲致病力增長的幅度不一致。

２．２菌株Ｂｂ－２次級代謝產(chǎn)物毒力測定結(jié)果

試驗結(jié)果（圖３）表明，真菌菌株Ｂｂ－２發(fā)酵液對２齡小菜蛾幼蟲和桃蚜成蚜均有一定的活性，對桃蚜活性明顯高于對小菜蛾的活性。２４ ｈ桃蚜校正死亡率為６１．１％，而２齡小菜蛾幼蟲校正死亡率僅為２６．７％；４８ ｈ桃蚜校正死亡率上升為７９．６％，而２齡小菜蛾幼蟲校正死亡率為３５．６％。發(fā)酵液對同種昆蟲的活性也不盡相同，隨著時間的增加，桃蚜的死亡率也在增加，２４ ｈ桃蚜大量死亡，４８ ｈ校正死亡率達到７９．６％。而２齡小菜蛾幼蟲死亡率隨時間的增加變化不明顯，２４ ｈ的校正死亡率為２６．７％，４８ ｈ的校正死亡率為３５．６％。

３結(jié)論與討論

本次試驗測定了球孢白僵菌菌株Ｂｂ－２不同濃度孢子懸浮液及其次生代謝產(chǎn)物對２齡小菜蛾幼蟲和桃蚜的毒力。結(jié)果表明，無論孢子懸浮液還是次生代謝產(chǎn)物對桃蚜的毒力均要明顯高于對２齡小菜蛾幼蟲的毒力。孢子懸浮液侵染力測定結(jié)果表明，在２５ ℃條件下，采用１．１×１０７、１．１×１０８、１．１×１０９個孢子／ｍＬ ３個濃度的孢子懸浮液對２齡小菜蛾幼蟲和桃蚜成蚜均表現(xiàn)出致病力。隨著接種孢子濃度的增加，菌株Ｂｂ－２對小菜蛾和桃蚜的致病力增強。在高濃度（１．１×１０９個孢子／ｍＬ）條件下，小菜蛾２齡幼蟲的死亡率為７５．０％，而桃蚜的死亡率高達９２．５％；在低濃度條件下，小菜蛾２齡幼蟲的死亡率為３６．７％，桃蚜的死亡率為４７．７％。次級代謝產(chǎn)物毒力測定結(jié)果表明，真菌菌株Ｂｂ－２發(fā)酵液對２齡小菜蛾幼蟲和桃蚜均有一定的活性，對桃蚜活性明顯高于對小菜蛾的活性。２４ ｈ桃蚜校正死亡率為６１．１％，而２齡小菜蛾幼蟲僅為２６．７％。４８ ｈ桃蚜校正死亡率上升為７９．６％，而２齡小菜蛾幼蟲校正死亡率為３５．６％。

蚜蟲不僅吸食植物汁液，引起植物營養(yǎng)惡化，而且是許多植物病毒的傳毒媒介，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)和研制生物殺蟲劑，控制蚜蟲的發(fā)生與為害，具有重大意義。本研究中應(yīng)用的球孢白僵菌Ｂｂ－２菌株無論活體孢子還是次級代謝產(chǎn)物對桃蚜均具有較高的毒力，說明該菌株具有一定的應(yīng)用潛力，值得進一步研究。

參考文獻：

［１］ 周傳恩．我國殺蟲微生物的應(yīng)用研究進展及發(fā)展前景［Ｊ］．農(nóng)藥，２００１，４０（７）：８－１０．

［２］ 張繼祖，徐金漢．中國南方地下害蟲及其天敵［Ｍ］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，１９９６．１５２－１５３．

［３］ 何余容，呂利華，鄺灼彬，等．球孢白僵菌不同分離株的生物學(xué)及對小猿葉甲成蟲致病性測定［Ｊ］．昆蟲知識，２００４，４１（５）：４４２－４４５．

［４］ 何恒果，李正躍，陳斌，等．侵染馬鈴薯塊莖蛾幼蟲的球孢白僵菌對桃蚜的毒力測定［Ｊ］．農(nóng)藥，２００４，４３（１）：２２－２４．

［５］ 馮明光，徐均煥，屠國興．殺蟲真菌制劑的開發(fā)與應(yīng)用前景［Ｊ］．杭州科技，１９９９，２０（４）：１９－２１．

［６］ 孫魯娟，吳孔明，郭予元．不同溫、濕度下白僵菌對棉鈴蟲幼蟲的致病力［Ｊ］．昆蟲學(xué)報，２００１，４４（４）：５０１－５０６．

［７］ 何恒果，李正躍．球孢白僵菌4菌株對桃蚜的控制效果研究［Ｊ］．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，２００6，28（1）：13－17．

［8］ 單樂天，馮明光．不同寄主及地理來源的１６株綠僵菌對桃蚜的毒力比較［Ｊ］．微生物學(xué)報，２００６，４６（４）：６０２－６０７．

［9］ 戴美學(xué)，祖愛民．灰綠擬青霉Ｕ－２發(fā)酵液殺蚜活性物質(zhì)的分離提取［Ｊ］．生物技術(shù)，１９９７（３）：３２－３４．