向日葵食用蛋白的提取和SDS-PAGE電泳技術(shù)研究

劉宇新,靳力爭(zhēng),張仲國(guó),魯福成,蘇麗娜

摘要：以向日葵種子為材料，采用SDS-PAGE電泳技術(shù)，以不同電泳條件對(duì)23種向日葵食用蛋白進(jìn)行電泳譜帶分析試驗(yàn)，研究不同電泳條件下向日葵食用蛋白的譜帶變化，以選擇出最佳的電泳條件。結(jié)果顯示，最佳試驗(yàn)條件為：按照質(zhì)量與體積比1∶3的比例用去離子水在4 ℃條件下30 min提取水溶性蛋白。電泳時(shí)，在4 ℃條件下進(jìn)行，凝膠板厚度1 mm，分離膠濃度8%，濃縮膠濃度5%，電壓300 V，加樣量控制在10 μL。

關(guān)鍵詞：向日葵；種子貯藏蛋白；聚丙烯酰胺凝膠電泳；品種純度

中圖分類號(hào)：S565.503.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.02.003

Technical Study on the Edible Protein Extraction from Sunflower and Protein Analysis with SDS-PAGE Electrophoresis

LIU Yu-xin1, JIN Li-zheng1, ZHANG Zhong-guo1, LU Fu-cheng1, SU Li-na2

(1. Tianjin Horticultural Engineering Institute，Tianjin 300384，China; 2.Tianjin Academy of Agricultural Sciences, Tianjin 300192, China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ: Taking sunflower seeds as materials, with different electrophoretic conditions, 23 kinds of edible sunflower protein electrophoresis band were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis, in order to study the variations of electrophoresis protein bands of edible sunflower under different conditions and choose the best electrophoretic conditions. The results showed that optimum conditions were: according to the ratio of weight and volume 1∶3, deionized water was used at 4 ℃ for 30 min to extract soluble proteins. Electrophoresis was done at 4 ℃ under the conditions of the gel thickness 1 mm, gel concentration of 8%, 5% stacking gel concentration, voltage 300 V, plus sample volume 10 μL.

Key words: sunflower;seed storage protein;polyacrylamide gel electrophoresis;varietal purity

向日葵種子是優(yōu)質(zhì)食用油和優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源之一[1]。它含有球蛋白、清蛋白和油脂體蛋白等豐富的蛋白質(zhì)。目前，關(guān)于向日葵的蛋白分離、鑒定工作較少。Kumar等[2]運(yùn)用SDS-PAGE電泳對(duì)向日葵的雜交種進(jìn)行對(duì)比分析, 并對(duì)雜種一代的遺傳純度進(jìn)行鑒定。謝宗銘等[3]采用SDS-PAGE電泳分離大量向日葵種子蛋白, 并將其應(yīng)用于自交系和雜交種的鑒定, 獲得良好效果。

食用蛋白即種子貯藏蛋白。自70年代以來,蛋白質(zhì)電泳技術(shù)開始應(yīng)用于種子品種鑒定和純度檢驗(yàn),并得到迅速推廣。國(guó)外研究多以高蛋白含量葵花籽為原料, 采用石油醚脫脂后再分離蛋白質(zhì)[4]，筆者從不同品種向日葵種子的微量樣品中獲得蛋白質(zhì),并利用SDS-PAGE電泳分離技術(shù)研究蛋白含量和種類的差異。本試驗(yàn)對(duì)向日葵種子貯藏蛋白的最佳提取方法和最佳SDS-PAGE電泳條件的確定及SDS-PAGE電泳技術(shù)在向日葵品種鑒定上的應(yīng)用進(jìn)行了研究。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

食葵：龍食葵、祥和；油葵：HA300(2002)、天龍黑油、2603、A01-6-7、89By-14、AS04-2、AS03-1-1、A04-5-3、PR29-9、PR29-8、PR29B、PR29-0607、HA89、td黑、吉35、HA300-55（C）、康地5號(hào)、89By-15、AS03-6-7、89By、長(zhǎng)城T012244。

1.2試驗(yàn)試劑

丙烯酰胺、N，N-亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨(AP)、TEMED、Tris、甘氨酸、溴酚藍(lán)、甘油、考馬斯亮藍(lán)R-250、無水乙醇、冰乙酸。

1.3試驗(yàn)方法

（1）樣品預(yù)處理。取每種種子2粒，粉碎研磨成細(xì)末。將粉碎樣品分別裝于1.5 mL離心管中，稱質(zhì)量，按種子∶雙蒸水=1∶3的量加水，將處理好的EP管放入4 ℃冰箱靜置30～60 min提取蛋白。

（2） 總蛋白質(zhì)的提取。將靜置好的蛋白EP管放入離心機(jī)中，4 ℃，1 000 rpm，離心10 min，準(zhǔn)備相同數(shù)目的EP管標(biāo)記備用，吸取上清轉(zhuǎn)移至備用EP管中，按1∶1加入上樣緩沖液，沸水中煮沸5 min，將處理后的EP管放入-20 ℃冰箱備用。

2結(jié)果與分析

2.1蛋白質(zhì)提取分析

2.1.1蛋白質(zhì)類型的確定向日葵食用蛋白根據(jù)溶解特點(diǎn)的不同，分為水溶性、鹽溶性和醇溶性。不同溶解特性的蛋白在含量和電泳條帶的特性上有很大的區(qū)別。通過對(duì)3組電泳條帶分析，根據(jù)表1可以看出，不同的組合其電泳條帶各有不同，其中水溶組電泳條帶表型最佳，適用于蛋白分析，選擇水溶性蛋白進(jìn)行分析。

2.1.2水溶性蛋白最佳提取方法的確定選擇4種方法對(duì)水溶性蛋白進(jìn)行提取，經(jīng)相同條件電泳后，根據(jù)表2可以看出，方法二提取的蛋白經(jīng)電泳后，譜帶數(shù)與其余3種接近，但譜帶擴(kuò)散和拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，干擾正常分析。從簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作的角度，選擇方法三為最佳提取方法。

2.2 電泳條件分析

2.2.1不同凝膠板厚度對(duì)電泳的影響試驗(yàn)分別選用1 mm和1.5 mm兩種厚度的凝膠板電泳槽，經(jīng)相同品種和相同條件下電泳后比較，發(fā)現(xiàn)1 mm厚度的膠板在蛋白譜帶的效果和染色方面的表現(xiàn)均好于1.5 mm厚度的膠板，經(jīng)分析，選用1 mm厚度的凝膠板最佳。

2.2.2不同分離膠濃度對(duì)電泳的影響試驗(yàn)分別選用濃度為8%，10%和12%的分離膠，經(jīng)相同品種和相同條件下電泳后比較發(fā)現(xiàn)，凝膠濃度越高，電泳時(shí)間越長(zhǎng)，電泳譜帶丟失越嚴(yán)重，經(jīng)分析，選擇8%濃度的分離膠最適宜（表3）。

2.2.3不同加樣量對(duì)電泳的影響試驗(yàn)分別選用5，10，15 μL 3種加樣量，經(jīng)相同品種和相同條件下電泳后比較發(fā)現(xiàn)，濃度過低，電泳譜帶不清晰且有部分丟失，濃度過高，電泳譜帶過寬且重疊，經(jīng)分析選擇10 μL的加樣量最佳（表4）。

2.3蛋白電泳分析

向日葵食用蛋白凝膠電泳譜帶根據(jù)分子量大小可劃分為а、β、γ3個(gè)區(qū)域。а區(qū)為小分子量蛋白質(zhì),該區(qū)域譜帶數(shù)量少，譜帶擴(kuò)散，染色淺，品種間差異不太顯著，在蛋白分析中作為次譜帶區(qū)域。β區(qū)為中分子量蛋白質(zhì),該區(qū)域中譜帶數(shù)量多，染色深，品種間差異顯著，在蛋白分析中作為主譜帶區(qū)域。γ區(qū)為高分子量蛋白質(zhì)，該區(qū)域譜帶數(shù)量多，染色譜帶細(xì)，品種間差異小，最好不作蛋白分析用。

通過對(duì)電泳圖譜的分析看出，向日葵水溶性蛋白可分離出20條左右的譜帶，且具備多態(tài)性，各品種間的蛋白譜帶在條帶的有無、顏色的深淺、寬度上均存在不同程度的差異。從圖1可看出，AS04-2、AS03-1-1、AS04-5-3在β區(qū)存在差異，與AS03-1-1相比，AS04-2少3條譜帶，而AS04-5-3則少2條譜帶。同樣，在PR29-8和PR29-9間也存在差異，PR29-8比PR29-9在β區(qū)少一條譜帶，且有一條相同遷移率的譜帶在顏色上有明顯的差異。

3討論

目前,蛋白質(zhì)組學(xué)研究越來越受到人們的關(guān)注,成為后基因組時(shí)代的重要研究領(lǐng)域之一[5]。電泳作為一種快速、簡(jiǎn)單、高效分離種子蛋白的方法,近年來得到廣泛應(yīng)用[6-7]。前人曾報(bào)道從單粒向日葵種子中提取向日葵蛋白質(zhì)用于單向電泳鑒定自交系和雜交種取得成功[8]。從微量樣品提取蛋白質(zhì)的方法可以做到快速、節(jié)省樣品及節(jié)約成本。Karine等[9]用少量擬南芥樣品(10 mg)進(jìn)行了雙向電泳分析。

本研究初步確定了向日葵種子蛋白的最佳提取方法：醇溶法加樣時(shí)蛋白不下沉使加樣困難，鹽溶法提取蛋白不多，水溶法提取2S水溶蛋白最好。初步確定了SDS-PAGE電泳最佳條件：電泳緩沖液pH值 8.3，4 ℃，凝膠板厚度1 mm，分離膠濃度8%，濃縮膠濃度5%，電壓300 V，加樣量控制在10 μL。初步進(jìn)行了不同品種向日葵食用蛋白的電泳譜帶分析。不過,這些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其功能有待于進(jìn)一步深入研究, 例如通過氨基酸分析, N端測(cè)序或質(zhì)譜分析, 確定其序列、種類, 再結(jié)合圖像分析,進(jìn)一步明確它們的生理生化功能[10]。

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