腋臭患者ApoD表達(dá)變化及其分子機(jī)制的研究

陳輝 穎利　杜潔　王芳芳

[摘要]目的：觀察與E-3M2H分泌相關(guān)的載脂蛋白D（ApoD）和雄激素受體AR在腋臭患者的大汗腺的表達(dá)與正常人的差異，探討導(dǎo)致腋臭患者ApoD表達(dá)異常的原因。方法：收集4例正常對(duì)照和10例腋臭患者的組織樣本，采用免疫組化、realtime-PCR和western-blot檢測(cè)腋臭患者組織中ApoD、AR的表達(dá)水平，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)和激素誘導(dǎo)，分析AR信號(hào)調(diào)控ApoD表達(dá)的可能性，并闡明JNK1信號(hào)通路在其中扮演的作用。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ApoD和AR在腋臭患者的大汗腺的表達(dá)與正常人有明顯的差異，腋臭患者中ApoD表達(dá)幾乎是正常人的2倍；而腋臭患者中AR表達(dá)也明顯增加，與此同時(shí)，腋臭患者中JNK1活化增強(qiáng)。雄激素可以增強(qiáng)正常人ApoD的表達(dá)，且該過(guò)程中同樣伴有JNK1活化；抑制JNK1活化，可以降低腋臭患者和雄激素誘導(dǎo)的ApoD的表達(dá)。結(jié)論：ApoD表達(dá)增加是腋臭患者的重要分子特征，其表達(dá)增加與AR 信號(hào)增強(qiáng)密切相關(guān)。JNK1的活化是腋臭患者和雄激素導(dǎo)致的ApoD表達(dá)增加的重要原因，抑制JNK1活化，可以抑制腋臭患者內(nèi)源和雄激素誘導(dǎo)的ApoD的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]腋臭；載脂蛋白D（ApoD）；JNK；表達(dá)調(diào)控

[中圖分類號(hào)]R758.74[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）11-1956-05

腋臭是整形美容外科的常見(jiàn)病，給患者帶來(lái)很大的精神和心理壓力，影響正常的生活和工作。目前治療腋臭的方法很多，治療效果多不相同，具有一定的創(chuàng)傷和并發(fā)癥。進(jìn)一步闡明腋臭發(fā)生的分子機(jī)制，在深入認(rèn)識(shí)腋臭發(fā)生病理機(jī)制的同時(shí)，有望發(fā)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)治療腋臭的新手段，對(duì)腋臭治療具有重要的意義。研究表明，（E）-3-甲基-2-已烯酸（E-3M2H）的分泌在腋臭發(fā)生過(guò)程中具有重要作用，而載脂蛋白D（ApoD）是調(diào)控其分泌的重要分子。然而，腋臭患者中ApoD的表達(dá)情況及其與腋臭的關(guān)系尚不清楚。深入分析腋臭患者中ApoD的表達(dá)及其機(jī)制，對(duì)于認(rèn)識(shí)腋臭的發(fā)生具有重要的意義。本研究將集中探討腋臭患者AR和ApoD的表達(dá)變化及其相關(guān)性；分析AR信號(hào)是否可能調(diào)節(jié)大汗腺中ApoD的表達(dá)，特別是JNK1信號(hào)在其中扮演的可能角色。

1材料和方法

1.1 臨床樣本收集：收集2009年10月到2010年5月在第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院整形激光美容中心手術(shù)治療腋臭的男性患者腋下組織標(biāo)本10例，同時(shí)募集4例男性志愿者（瘢痕修復(fù)患者或其他原因）。術(shù)中取患者左右兩側(cè)腋下新鮮皮膚組織約6cm×0.3cm×0.3cm（深及脂肪層）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)：取自患者和志愿者的腋窩處皮膚經(jīng)D-Hanks液沖洗后，剔除脂肪組織。用眼科手術(shù)剪將皮膚剪成1mm3的小組織塊。然后用II型膠原酶孵箱中消化1天。1天后，鏡下獲取汗腺組織，移入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入少許培養(yǎng)基，待汗腺組織塊貼壁后繼續(xù)加入2ml培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 每2～3天換液一次。通常汗腺上皮中混有成纖維細(xì)胞，而后者與汗腺上皮相比，貼壁較差。 為了純化汗腺上皮細(xì)胞，通過(guò)胰酶分步消化的方法獲取汗腺上皮細(xì)胞。胰酶消化后，首先脫落的是成纖維細(xì)胞，吸棄后，繼續(xù)消化依然貼壁的汗腺上皮，則能獲取較為純的汗腺上皮細(xì)胞。整個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM+10% FBS。

1.3 細(xì)胞處理

1.3.1 JNK抑制劑處理：將上述培養(yǎng)的腋臭患者細(xì)胞鋪板于6孔板，隔夜培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%后給予JNK抑制劑處理，抑制劑濃度為10-6M，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞用于基因表達(dá)檢測(cè)。

1.3.2 5α-DHT處理：將培養(yǎng)的正常人細(xì)胞鋪板于6孔板，隔夜培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%后給予5α-DHT 處理，劑量分別為10-7M 和10-6M 。此外，我們還在10-6M 濃度的5α-DHT基礎(chǔ)上聯(lián)合添加JNK抑制劑處理，抑制劑濃度為10-6M，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞用于基因表達(dá)檢測(cè)。

1.4 Western Blot檢測(cè)目的基因表達(dá)

1.4.1 收集蛋白樣品（Protein sample preparation）：將處理完的細(xì)胞，PBS洗滌后，按每孔加入80μl的RIPA蛋白裂解液，冰上孵育30min。收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，采用Pierce 公司的BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。將適量濃縮的5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液加入收集的蛋白樣品中。沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白，離心后取上清備用。

1.4.2. 電泳（Electrophoresis）：首先配制SDS-PAGE凝膠，制備好后，把蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)。為便于觀察電泳和轉(zhuǎn)膜效果、判斷蛋白分子量大小，在邊緣加樣孔中加入預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker。

1.4.3 轉(zhuǎn)膜（Transfer）：本實(shí)驗(yàn)中使用硝酸纖維素膜（NC膜）進(jìn)行轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移條件為：電流為200mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為120min。整個(gè)過(guò)程在冰浴中進(jìn)行。根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker，判斷轉(zhuǎn)膜的效果。

1.4.4 封閉（Blocking）：轉(zhuǎn)膜完成后，即刻把蛋白膜放到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液TBST中，漂洗1～2min，洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。吸盡洗滌液后，加入含有10%的脫脂牛奶的Western封閉液，放置于搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉120min。

1.4.5 一抗孵育（Primary antibody incubation）：按照預(yù)染Marker的指示，將目的基因所在位置的條帶剪下。參照一抗的說(shuō)明書，按照合適比例用TBST稀釋一抗，達(dá)到合適濃度。用微型臺(tái)式真空泵吸盡封閉液，即刻加入稀釋好的一抗4℃孵育過(guò)夜。

1.4.6 二抗孵育（Secondary antibody inucubation）：參照二抗的說(shuō)明書，按照合適比例，用TBST稀釋辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗。 二抗時(shí)需要根據(jù)一抗進(jìn)行選擇。例如一抗是小鼠來(lái)源的IgG，則二抗需要選擇抗小鼠IgG的二抗，比如用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG。

1.4.7 蛋白檢測(cè)（Detection of proteins）：采用碧云天的BeyoECL Plus ECL類試劑檢測(cè)蛋白。壓片采用專用的壓片暗盒（FFC58/FFC83）進(jìn)行。 用顯影定影試劑盒（P0019/P0020）配制顯影液和定影液，自行手工洗片。X光片選用柯達(dá)原裝的生物實(shí)驗(yàn)專用柯達(dá)X-OMAT BT膠片。

1.5 免疫組化檢測(cè)目的基因表達(dá)

1.5.1配制試劑

1.5.2 操作流程：脫蠟和水化；高壓熱修復(fù)抗原；組織切片染色；脫水、透明、封片、鏡檢、照相。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)

1.6.1 提取高質(zhì)量的RNA：因?yàn)镽eal-Time PCR對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止RNA的降解，整個(gè)過(guò)程在冰上完成。具體步驟略

1.6.2 瓊脂糖凝膠電泳RNA，分析提取RNA的質(zhì)量：配制1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠；取各個(gè)RNA樣品4μl，加入6×RNA電泳上樣緩沖液2μl混勻，加入變性膠加樣孔中。120V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察，確定可見(jiàn)28S和18S 兩條明亮條帶，而無(wú)DNA條帶污染。

1.6.3 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。紫外分光光度計(jì)RNA定量。反轉(zhuǎn)錄體系（略）。

1.6.3.1 引物設(shè)計(jì)：由于本實(shí)驗(yàn)采用SYBR Green I做 Real Time PCR，引物設(shè)計(jì)滿足特定的要求。由于RNA純化后得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會(huì)用一些看家基因來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。本研究用的看家基因?yàn)镚APDH。

1.6.3.2 引物質(zhì)量檢測(cè)：取0.2ml薄壁PCR管，向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10μl；加入正反向引物各0.5μl（引物濃度10μM），向管中加入混合的cDNA各1μl。各管補(bǔ)加水至20μl?；靹颍糜贏B7500PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃ 5min；95℃15s，60℃34s，40cycles；加溶解曲線； 4℃終止反應(yīng)。

設(shè)計(jì)的引物的溶解曲線見(jiàn)圖1、2。兩對(duì)引物的溶解曲線均單一，表明產(chǎn)物特異，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。利用相對(duì)定量的方法分析目的基因表達(dá)量的情況，計(jì)算表達(dá)差異， 采用2-△△CT方法分析基因表達(dá)相對(duì)變化。

2結(jié)果

2.1 大汗腺的形態(tài)學(xué)觀察：大汗腺的分泌活動(dòng)有可能在機(jī)體內(nèi)環(huán)境和外部因素的變化下，在活躍期和靜息期之間往復(fù)循環(huán)。我們對(duì)大汗腺的形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在腋臭標(biāo)本和正常標(biāo)本切片中均可以看到各種分泌時(shí)期的大汗腺，但對(duì)照組的大汗腺組織明顯少于腋臭組，有的切片幾乎沒(méi)有。分泌活躍期的大汗腺管腔小，細(xì)胞呈柱狀并且頂部凸出到管腔中央形成帽狀物，有的已經(jīng)脫離大汗腺游離到管腔中央（圖3）。分泌靜息期的大汗腺管腔大，細(xì)胞呈扁平狀，沒(méi)有凸出到管腔的分泌物（圖4）。

2.2 ApoD、AR免疫組織化學(xué)結(jié)果：腋臭組大汗腺細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)密集分布的棕黃色深染顆粒，ApoD的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性（圖5）。正常對(duì)照組大汗腺細(xì)胞漿內(nèi)僅見(jiàn)少量棕黃色淺染顆粒，ApoD表達(dá)呈弱陽(yáng)性（圖6）。ApoD在腋臭組大汗腺中的表達(dá)高于對(duì)照組。正常對(duì)照組中大汗腺細(xì)胞核內(nèi)僅有少量棕黃色淺染顆粒，AR的表達(dá)呈弱陽(yáng)性（圖7）；而腋臭組大汗腺細(xì)胞中可見(jiàn)核內(nèi)密集分布的棕黃色深染顆粒，AR的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性（圖8）。

2.3 Real-time檢測(cè)ApoD的表達(dá)差異：我們提取了10例腋臭的男性患者和4例正常對(duì)照的腋下組織標(biāo)本，對(duì)其中ApoD的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4例正常對(duì)照中ApoD表達(dá)水平相對(duì)較低，而10例腋臭患者中ApoD的表達(dá)水平則比較高。腋臭患者中ApoD的平均表達(dá)水平是正常的2倍左右 （圖9）。秩檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。

2.4 腋臭患者JNK1活化增強(qiáng)：對(duì)上述14例樣本進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。同時(shí)，我們檢測(cè)了JNK1的表達(dá)和活化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JNK1表達(dá)在正常和腋臭患者之間沒(méi)有顯著差別，而腋臭患者中JNK1的磷酸化明顯增強(qiáng)（圖10），表明腋臭患者中JNK1的磷酸化明顯增強(qiáng)，提示增強(qiáng)的JNK1信號(hào)可能是腋臭發(fā)病的重要分子事件。

在上述研究的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步探討了抑制JNK1信號(hào)，能否減少ApoD的表達(dá)。為此，我們培養(yǎng)了腋臭患者的汗腺細(xì)胞。將培養(yǎng)的細(xì)胞鋪板于6孔板后，給予JNK1抑制劑SP600125處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JNK1抑制劑能夠有效地抑制JNK1的磷酸化和ApoD的表達(dá)水平（圖11），提示JNK1是ApoD表達(dá)增加的重要原因。

為了進(jìn)一步分析JNK1調(diào)控ApoD表達(dá)究竟是發(fā)生在蛋白水平，還是RNA水平。我們又進(jìn)一步分析了ApoD的RNA表達(dá)水平。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，JNK1抑制劑同樣能夠有效抑制ApoD的RNA表達(dá)水平（圖12）。表明JNK1是通過(guò)調(diào)控ApoD的轉(zhuǎn)錄影響ApoD的表達(dá)的。

先前的研究發(fā)現(xiàn)，AR可以調(diào)控JNK1的活化；而JNK1同樣可以促進(jìn)AR的轉(zhuǎn)錄活性。為此，我們進(jìn)一步探討了AR信號(hào)是否通過(guò)影響JNK1的活化調(diào)控ApoD的表達(dá)，還是其他信號(hào)引起JNK1活化，后者引起AR轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，進(jìn)而引起ApoD表達(dá)增強(qiáng)。培養(yǎng)正常人汗腺細(xì)胞后，給予10-7M、10-6M的5α-DHT刺激。24h 5α-DHT刺激，濃度依賴的增強(qiáng)ApoD的表達(dá)，而JNK1則能一定程度的抑制ApoD的表達(dá)增加 （圖13）。所有這些證據(jù)提示AR信號(hào)可以以JNK1依賴和非依賴兩種方式調(diào)控ApoD的表達(dá)。

在RNA水平，我們觀察到類似的現(xiàn)象（圖14）。5α-DHT濃度依賴的增強(qiáng)ApoD的mRNA水平，而JNK1則能一定程度的抑制ApoD的表達(dá)增加。

3討論

腋臭是一種常見(jiàn)病，漢族人的發(fā)病率是4.56%[1]，有家族遺傳性[2]。該病的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，近年來(lái)的研究[3]認(rèn)為與大汗腺分泌功能異常有關(guān)，大汗腺細(xì)胞在腋臭發(fā)生中起重要的作用。已有研究[4]證明大汗腺分泌物氣味結(jié)合蛋白（aprocrine secretion odor-binding protein， ASOB）與腋臭重要?dú)馕斗肿覧-3-甲基-2-已烯酸（E-3-methyl-2- hexenoic acid E-3M2H）的分泌相關(guān)。臭味的主要成分是E-3M2H，其中也有一定量的揮發(fā)性硫化合物[5]。性激素對(duì)腋臭有一定調(diào)控作用[6]，所以此病高發(fā)于青春期。Kurata等人的實(shí)驗(yàn)研究表明，腋部大汗腺是雄激素受體（androgen receptor，AR）的靶器官[7]。Beier等[6]指出大汗腺的細(xì)胞核中有雄激素受體的表達(dá)，這種表達(dá)無(wú)性別差異。人大汗腺中的ASOB有兩種形式：ASOB1和ASOB2[8]，ASOB2在氣味的運(yùn)輸過(guò)程中起主導(dǎo)作用[9]。E-3M2H在細(xì)胞質(zhì)中同ASOB2分子的N-末端的谷氨酰胺殘基以共價(jià)鍵結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物由ASOB2分子運(yùn)輸?shù)狡つw表面后被細(xì)菌分解成化合物E-3M2H和3羥基-3甲基已酸（HMHA）和谷氨酰胺（Gln），從而產(chǎn)生特殊的臭味。但也有報(bào)道，在無(wú)菌條件下培養(yǎng)的大汗腺細(xì)胞也可以產(chǎn)生特殊的臭味[10]。AR和ASOB間有著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，也是腋臭發(fā)生機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，我們也從形態(tài)學(xué)和蛋白水平研究了AR和ASOB在大汗腺細(xì)胞中的表達(dá)及其相關(guān)性，還有待從基因水平進(jìn)行研究和驗(yàn)證。E-3M2H的分泌增加是腋臭發(fā)生的重要分子基礎(chǔ)，而ApoD是調(diào)節(jié)E-3M2H分泌的重要基因。

綜上可見(jiàn)，E-3M2H的分泌多少是腋臭發(fā)生的起始因素，而ApoD基因自身及其調(diào)控因素的差異可能是疾病發(fā)生的原因。性激素通過(guò)其受體調(diào)節(jié)基因的活性，調(diào)控ApoD表達(dá)，參與重要生理和病理過(guò)程。截至目前，激素水平和激素受體在腋臭發(fā)生發(fā)展中的作用研究還很少。而最近在前列腺癌的研究表明AR可以調(diào)節(jié)ApoD的表達(dá)[11]，提示AR信號(hào)可能參與了腋臭發(fā)病過(guò)程中ApoD的表達(dá)調(diào)控。

本研究發(fā)現(xiàn)，AR信號(hào)可以通過(guò)JNK1刺激ApoD的表達(dá)；但抑制JNK1并不能完全阻斷AR信號(hào)對(duì)ApoD的表達(dá)上調(diào)；提示AR還可以通過(guò)JNK1非依賴的方式刺激ApoD的表達(dá)。此外，JNK1本身可以刺激AR的轉(zhuǎn)錄活性，提示JNK1 可能通過(guò)調(diào)控AR信號(hào)調(diào)節(jié)ApoD的表達(dá)。因此，可以設(shè)想AR信號(hào)和JNK1信號(hào)之間存在某種反饋。需要指出的是，JNK1的活化不僅受到激素的調(diào)控，體內(nèi)多種刺激可以促進(jìn)JNK1的活化，而腋臭患者中JNK1活化增強(qiáng)有無(wú)其它因素同樣是值得探討的重要科學(xué)問(wèn)題。

綜上，本部分實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)：AR信號(hào)可以通過(guò)活化JNK1，促進(jìn)ApoD的表達(dá)。進(jìn)一步研究JNK1活化和ApoD表達(dá)在腋臭發(fā)生中的作用，對(duì)加深腋臭發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)和無(wú)創(chuàng)治療腋臭具有重要的意義。

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[收稿日期]2012-07-21[修回日期]2012-09-28

編輯/張惠娟