SFRP2基因重組腺病毒載體的構建與鑒定

王儆等

[摘要]目的：成功構建攜帶SFRP2基因的腺病毒載體。方法：從pGBKT-SFRP2質粒中擴增SFRP2基因，將SFRP2基因亞克隆至質粒穿梭載體pAd-Track-CMV。用脂質體轉染法將重組腺病毒pAd-Track-PPARγ2-CMV和pAdEasy-1共轉染293細胞，成功構建的重組腺病毒Ad-SFRP2，確定轉染效率。原代培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細胞，利用Ad-SFRP2感染該細胞。通過RT-PCR和Western Blot分別檢測感染后人瘢痕成纖維細胞及對照組細胞中SFRP2基因mRNA和蛋白表達水平。結果：RT-PCR檢測結果顯示腺病毒Ad-SFRP2的PCR產物約為904bp，SFRP2 mRNA表達水平明顯增高；用抗SFRP2多克隆抗體進行Western blot檢測為陽性，感染的重組腺病毒載體在人瘢痕成纖維細胞中SFRP2蛋白有較高的穩(wěn)定表達。結論：成功構建含有人SFRP2基因的重組腺病毒Ad-SFRP2；它可有效提高人增生性瘢痕成纖維細胞中SFRP2基因的表達水平。

[關鍵詞]SFRP2；腺病毒；增生性瘢痕；成纖維細胞

[中圖分類號]R318[文獻標識碼] [文章編號]1008-6455（2012）11-1981-04

成纖維細胞作為創(chuàng)傷愈合時的主要效應細胞，在包含增生性瘢痕和瘢痕疙瘩在內諸多以過度增生為特征的病變中，常常表現(xiàn)為凋亡抑制，進而引發(fā)一系列連鎖反應造成創(chuàng)面修復失控并最終導致過度纖維化而形成增生性瘢痕[1]。我們過去運用從基因芯片中篩選出一個具有抑制細胞凋亡作用、在早期增生性瘢痕中呈顯著高表達的基因SFRP2[2-3]，該基因可能在增生性瘢痕形成的過程中起著重要作用。但是目前SFRP2調控增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的分子機制尚不明了，有必要進行進一步研究。

本實驗利用pAd-Easy腺病毒載體系統(tǒng)[4]，通過PCR擴增SFRP2基因，克隆到腺病毒載體pAdEasy共轉染293細胞，構建攜帶SFRP2基因的重組腺病毒，在體外感染人增生性瘢痕成纖維細胞以觀察SFRP2基因表達情況，為進一步研究該基因的功能奠定理論和實驗基礎。

1材料和方法

1.1 材料：pGBKT-SFRP2質粒（袁順宗博士惠贈）。感受態(tài)菌株及293細胞株（我院燒傷研究所）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Haclon公司）。限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶、T4DNA聚合酶、pMD18-T載體、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000（Takara公司）。Lipofectamine2000（Invitrogen公司）。Trizol及RT-PCR試劑（美國Invitrogen公司）。逆轉錄試劑盒（美國Fermentas公司）。兔抗人SFRP2多克隆抗體（美國CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 增生性瘢痕成纖維細胞的分離培養(yǎng)：采用組織塊法[6]進行增生性瘢痕成纖維細胞的原代培養(yǎng)，具體方法如下：將手術中取下的增生性瘢痕標本仔細切除皮下脂肪組織和表皮，用加有青霉素和鏈霉素的消毒蒸餾水洗滌3次，再用消毒生理鹽水漂洗3次；在少量含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中用鋒利的刀片將組織切割成約1mm大小的塊，并接種于25ml的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，待長成致密層以后，用2.5g/L的胰蛋白酶消化傳代，實驗所用的是第3～6代的細胞。

1.2.2 SFRP2編碼序列的擴增：采用Primer5.0軟件設計擴增人SFRP2基因氨基酸區(qū)域編碼序列的特異性引物，并在引物5'端引入保護性堿基和限制性酶切位點，其中，上游引物序列為：5'-GAAGATCT ATGCTGCAGGGCCCTGGC-3'，下游引物序列為：5'-TTGTCGAC CTAGCACTGCAGCTTGCGGATG-3'（畫線部分分別為BglII和SalI酶切位點）。以pGBKT-SFRP2質粒為模板進行PCR擴增，擴增體系組成為：5μl 10×PCR緩沖液、1μl 10mmol/L dNTPs、pGEX-IL-24重組質粒模板2μl、10μmol/L引物各1μl及DNA聚合酶1μl，用雙蒸水補足至50μl。擴增程序為：94℃變性5 min，然后用逐步程序94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min完成30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。

1.2.3SFRP2重組腺病毒表達載體的構建：2%瓊脂糖凝膠回收SFRP2擴增產物，與pMD19-T載體連接并轉化到DH5α菌中，藍白斑初步篩選，挑取單菌落提粒，BglII和SalI雙酶切及PCR鑒定，鑒定正確的質粒經BglII和SalI雙酶切，膠回收SFRP2目的片段，與線性化的pAdTrack-CMV載體相連接，轉化DH5α菌，BglII和SalI雙酶切鑒定并進行測序。測序正確的重組載體命名為pAdTrack-CMV-SFRP2。PmeⅠ單酶切消化10μg pAdTrack-CMV-SFRP2重組質粒，純化回收后獲得線性化載體，然后與0.1μg骨架質粒pAdEasy-1在2.5 kV，200Ω，25μF條件下電穿孔共轉化20μl BJ5183感受態(tài)細胞，卡那霉素抗性平板37℃培養(yǎng)16 h，挑取針尖大小的克隆，PacⅠ酶切鑒定正確后，再轉化DH5α菌中擴增。鑒定正確的重組載體命名為Ad-SFRP2，進行掃描獲取圖像。

1.2.4 SFRP2重組腺病毒的包裝與制備：按照Lipofectamine2000試劑盒說明書，取10μgPacⅠ酶切線性化的Ad-SFRP2轉染HEK293細胞。轉染后7～10天熒光顯微鏡觀察，根據綠色熒光蛋白GFP和細胞病變效應判斷病毒產生。收集細胞，磷酸鹽緩沖液重懸，-80℃和37℃反復凍融4次，12 000 r/min離心10 min，收集病毒上清，-80℃保存，取部分病毒上清液，再次感染HEK293細胞擴增腺病毒，按TCID法測定病毒滴度。

1.2.5 SFRP2重組腺病毒感染增生性瘢痕成纖維細胞：原代培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細胞經第3次傳代后，在150 mL/LDMEM中培養(yǎng)24h。將Ad-SFRP2純化病毒按其TCID50值加入到細胞培養(yǎng)基中，每15min輕搖1次，共4次，4h后換液。

1.2.6 RT-PCR檢測SFRP2表達水平：按Trizol試劑盒說明書分別提取Ad-SFRP2感染24h后的實驗組和陰性對照組增生性瘢痕成纖維細胞的總RNA。RT-PCR反應按照Fermentas反轉錄PCR試劑盒說明書進行操作，利用PrimerPrimer 5.0設計SFRP2的鑒定引物：上游5'-TGGGGGAAACGGTCGCACTC-3'，下游5'-GGCCACGAGACCATGAAGGAGG-3′。 PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃40s，35個循環(huán)；最后延伸72℃5 min。以GAPDH作為內參照（退火溫度55℃，25個循環(huán)），GAPDH上游引物5'-ACCCATCACCATCTTCCA GGAG-3'，下游引物5'-GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3'（上海生物工程技術服務有限公司合成），PCR反應結束后取10μL反應產物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察目的條帶。

1.2.7 Western blot檢測SFRP2表達水平：分別收集感染Ad-SFRP2 24h后和對照組細胞，提取蛋白。BCA法進行蛋白定量，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水浴5min，按照蛋白定量結果進行加樣，行120g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干法將蛋白轉移至硝酸纖維素（NC）膜上。NC膜用50g/L脫脂奶封閉1h，加入SFRP2 pAb （1∶500）或GAPDH mAb（1∶1000）工作液，4℃過夜，兔抗人二抗（1∶4000）于室溫下孵育1h，用ECL發(fā)光，膠片顯色，分析結果，以GAPDH作為內參照。

2結果

2.1 PCR擴增產物電泳結果：以pGBKT-SFRP2質粒為模板，PCR擴增產物為單一條帶，大小約904bp，見圖1。

2.2 SFRP2重組腺病毒載體的構建：將擴增產物克隆入pMD19-T載體，BglII和SalI雙酶切和PCR鑒定確認獲得陽性重組克?。▓D2）。進而將SFRP2片段亞克隆至pAdTrack-CMV載體，BglII和SalI雙酶切鑒定并經測序確認獲得陽性重組克隆，命名為pAdTrack-CMV-SFRP2（圖3、圖4）。線性化的pAdTrack-CMV-SFRP2質粒與骨架質粒pAdEasy-1在BJ5183菌中進行同源重組，PacⅠ酶切鑒定陽性重組子，可見1條約30 kb的片段和1條4.5 kb的小片段（圖5），表明同源重組成功，獲得SFRP2重組腺病毒載體，命名為Ad-SFRP2。同時，采用同樣方法，將pAdTrack-CMV空載體與骨架質粒pAdEasy-1進行同源重組，重組子命名為Ad-EGFP。

2.3 SFRP2重組腺病毒的包裝擴增及鑒定：用脂質體轉染293細胞有大量GFP表達，并可見細胞變圓呈串珠樣聚集（圖6），裂解粗提物中提取重組病毒DNA，PCR鑒定證實重組病毒基因組中含有目的基因SFRP2，提示重組質粒在293細胞轉染成功。收集病毒液，反復轉染293細胞最終得到滴度約為2.0×1010pfu/mL的重組腺病毒。

2.4 RT-PCR檢測結果：感染的增生性瘢痕成纖維細胞中提取mRNA的RT-PCR電泳結果顯示，以GAPDH為陽性對照，未感染病毒的增生性瘢痕成纖維細胞SFRP2、感染空病毒的增生性瘢痕成纖維細胞SFRP2與感染SFRP2腺病毒的增生性瘢痕成纖維細胞SFRP2表達一致。其產物為904bp特異條帶，且SFRP2腺病毒感染增生性瘢痕成纖維細胞后SFRP2基因表達明顯增高（圖7）。

2.6 Western blot檢測結果：用SFRP2多克隆抗體進行Western blot檢測，以GAPDH為陽性對照，結果證實感染重組腺病毒載體在增生性瘢痕成纖維細胞中SFRP2有較高的穩(wěn)定表達（圖8）。

3 討論

SFRP2是一個位于4號染色體q31.3，其全長約2kb，編碼大小約34kD的可溶性蛋白質，表達于胞漿，但也可分泌至胞外發(fā)揮作用。SFRP2蛋白所屬的SFRP家族具有富含半胱氨酸的結構域，該結構域同源于細胞表面卷曲受體（Frizzled receptors）的Wnt結合位點，但是SFRP2缺乏跨膜結構[5]。目前的研究表明，SFRP2通過調控Wnt信號為主要途徑的方式發(fā)揮其調節(jié)細胞抗凋亡的作用。表現(xiàn)為：①心肌修復過程中，SFRP2通過阻斷Wnt3a信號途徑、增加細胞核內β-catenin表達以對抗缺氧/復氧誘導的凋亡作用，從而調控心肌細胞修復[6]；②胃癌中過表達的SFRP2通過下調β-catenin-TCF/LEF的下游靶基因如LEF1，cyclin D1，MMP-7等來抑制Wnt信號，調節(jié)癌細胞的增殖與凋亡[7]；③乳腺癌中SFRP2主要通過活化NF-κB或抑制JNK信號來發(fā)揮其抗凋亡作用。同時SFRP2還可以通過與促進ECM中的纖維連接蛋白-整合素受體復合體（fibronectin-integrin receptor complexes）形成從而活化黏附斑激酶（FAK）及其下游信號途徑PI-3K-Akt來抑制細胞凋亡[8]。

除了抑制凋亡之外，SFRP2對細胞增殖、分化和運動也還具有一定的調節(jié)作用，并且SFRP2基因的甲基化被認為可用來作為糞便中結直腸癌的篩選標志[9-12]。文獻復習還提示SFRP2的高表達可以促進結締組織生長因子（CTGF）的基因表達水平增高[6]，而CTGF在HS組織中既可以促進Fb增生，又可以促進Fb-肌Fb轉分化和膠原合成[13]。

綜合上述內容，我們認為SFRP2在增生性瘢痕組織成纖維細胞中的高表達其主要作用可能在于引起成纖維細胞的凋亡抑制，同時還可能與成纖維細胞的增殖相關。根據既往文獻研究，我們進一步推測其調節(jié)增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的分子機制可能與Wnt信號相關，但也不排除還存在著新的信號途徑。然而以上推測尚需進一步的實驗證明。

本研究構建SFRP2重組腺病毒載體，在293細胞中表達、包裝、純化病毒后成功構建了攜帶SFRP2重組腺病毒。并且初步研究結果表明該重組病毒在體外能有效感染正常增生性瘢痕成纖維細胞，受感染細胞能高效穩(wěn)定的表達重組蛋白，為下一步研究SFRP2對病毒自身的復制與增殖以及宿主細胞中基因表達與調控、細胞凋亡等過程的機制奠定了基礎。

[參考文獻]

[1]Desmouliere A， Darby IA， Gabbiani G. Normal and pathologic soft tissue remodeling： role of the myofibroblast， with special emphasis on liver and kidney fibrosis[J].Lab Invest，2003， 83（6）：1689-1707.

[2]Wu J， Ma B， Yi S， et al. Gene expression of early hypertrophic scar tissue screened by means of cDNA microarrays[J].J Trauma 2004， 57（6）：1276-1286.

[3]Chen W， Fu X， Sun X， et al. Analysis of differentially expressed genes in keloids and normal skin with cDNA microarray[J].J Surg Res 2003， 113（2）：208-216.

[4]Tong-chuan He，Shibin Zhou，Luis TD，et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses[J].Proc Nat1 Acad Sci USA，1998，95（6）：2509-2517.

[5]Melkonyan HS， Chang WC， Shapiro JP， et al. SARPs： a family of secreted apoptosis-related proteins[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997， 94pp：13636-13641.

[6]Mirotsou M， Zhang Z， Deb A， et al. Secreted frizzled related protein 2 （Sfrp2） is the key Akt-mesenchymal stem cell-released paracrine factor mediating myocardial survival and repair[J].Proc Natl Acad Sci USA ，2007， 104（5）：1643-1648.

[7]Nojima M， Suzuki H， Toyota M， et al. Frequent epigenetic inactivation of SFRP genes and constitutive activation of Wnt signaling in gastric cancer[J].Oncogene，2007， 23（1）1-15.

[8]Lee JL， Chang CJ， Chueh LL， et al. Secreted frizzled related protein 2 （sFRP2） decreases susceptibility to UV-induced apoptosis in primary culture of canine mammary gland tumors by NF-kappaB activation or JNK suppression[J].Breast Cancer Res Treat，2006，100（1）：49-58.

[9]Lee HX， Ambrosio AL， Reversade B， et al. Embryonic dorsal-ventral signaling： secreted frizzled-related proteins as inhibitors of tolloid proteinases[J].Cell， 2006， 124（1）：147-159.

[10]Oshima T， Abe M， Asano J， et al. Myeloma cells suppress bone formation by secreting a soluble Wnt inhibitor， sFRP-2[J].Blood，2005， 106（12）：3160-3165.

[11]Muller HM， Oberwalder M， Fiegl H， et al. Methylation changes in faecal DNA： a marker for colorectal cancer screening[J]？ Lancet，2004， 363（5）：1283-1285.

[12]Roth W， Wild-Bode C， Platten M， et al. Secreted Frizzled-related proteins inhibit motility and promote growth of human malignant glioma cells[J].Oncogene，2000， 19（11）：4210-4220.

[13]Grotendorst GR， Duncan MR. Individual domains of connective tissue growth factor regulate fibroblast proliferation and myofibroblast differentiation[J].Faseb J，2005， 19（3）：729-738.

[收稿日期]2012-04-04 [修回日期]2012-06-28

編輯/張惠娟