MAPK和PI3K調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子 2α對(duì)慢性阻塞性肺疾病的作用

孔春初　戴愛(ài)國(guó)

[摘要] 目的 探討缺氧誘導(dǎo)因子2α（HIF-2α）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），磷酸肌醇3-激酶（PI3K） 的表達(dá)變化在缺氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）中的作用和意義。 方法 選擇COPD患者（24例）和非COPD對(duì)照組（28例）患者為研究對(duì)象，行HE染色檢測(cè)兩組患者肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)肺小動(dòng)脈壁內(nèi)P-AKT、P-ERK、P-JNK、P-P38表達(dá)水平，應(yīng)用原位雜交和免疫組化檢測(cè)肺小動(dòng)脈壁內(nèi)HIF-2α的表達(dá)水平。 結(jié)果 COPD患者管壁面積與管總面積比值及肺小血管中膜厚度均較對(duì)照組增高（P < 0.01）。COPD患者肺小血管壁P-ERK以及P-AKT和HIF-2α基因表達(dá)水平較對(duì)照組患者肺血管壁內(nèi)增強(qiáng)，而P-JNK、 P-P38表達(dá)水平較對(duì)照無(wú)明顯變化。 結(jié)論 MAPK信號(hào)通路和磷酸肌醇3－激酶（PI3K）信號(hào)通路以及HIF-2α可能參與了COPD患者HPH的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞] 絲裂原活化蛋白激酶；磷酸肌醇3－激酶；缺氧誘導(dǎo)因子2α；缺氧；高血壓，肺性

[中圖分類號(hào)] R563.9[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-9701（2012）21-0001-03

慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一種具有氣流受限特征的可以預(yù)防和治療的疾病，氣流受限不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對(duì)香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。COPD主要累及肺臟，但也可引起全身（或稱肺外）的不良反應(yīng)，長(zhǎng)期COPD患者因氣流長(zhǎng)期受限多存在低氧血癥，肺小動(dòng)脈痙攣，結(jié)構(gòu)重塑，最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓力增高，肺血管阻力增加，左心代償性肥厚，進(jìn)行導(dǎo)致慢性肺心病。HIF-2α是機(jī)體低氧適應(yīng)反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，由α功能亞基 （HIF-2α）和β結(jié)構(gòu)亞基（HIF-2β）組成[1-2]，可與下游目的基因的低氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，促進(jìn)低氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)適應(yīng)低氧狀態(tài)。筆者前期的研究提示，HIF-2α參與 COPD的肺血管重塑，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路調(diào)控HIF 在缺氧大鼠HPSR 形成中有重要作用[3-4]。本研究通過(guò)觀察COPD患者肺小動(dòng)脈壁內(nèi)HIF-2α與P-ERK、P-JNK、P-P38、P-Akt的表達(dá)變化，從而探討其在HPH發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇湖南省老年醫(yī)院胸外科2008年1～12月收治的行肺葉切除術(shù)患者52例，原發(fā)病為支氣管擴(kuò)張、肺癌、肺炎性假瘤、肺結(jié)核等。全部患者術(shù)前均進(jìn)行體檢、肺功能檢查、胸部CT、X線檢查，并結(jié)合病史進(jìn)行診斷。其中COPD患者24例，非COPD患者28例，COPD的診斷符合2002年合中華醫(yī)學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。COPD組24例患者中，男16例，女8例，年齡（61±5）歲，其中輕度5例，中度7例，第一秒用力呼氣容積（FEV1）占預(yù)計(jì)百分比為（68±7.1）%，切除標(biāo)本的位置位于肺右下葉7例，左上葉5例；對(duì)照組（無(wú)COPD者）28例，其中男18例，女10例，年齡（59±7）歲，切除標(biāo)本的位置位于右下葉8例，左上葉6例，F(xiàn)EV1占預(yù)計(jì)百分比為（90±4.5）%。兩組患者的性別、年齡、標(biāo)本位置比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)

切除標(biāo)本采用中性甲醛固定12 h，行常規(guī)石蠟包埋切片，然后在37℃溫控下采用0.125%胰蛋白酶消化20 min后行抗原修復(fù)，加入一抗體，抗體主要有小鼠抗人HIF－2α，P-ERK、P-JNK、P-P38、P-Akt 單克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，1∶100 稀釋）；即用型兔抗人iNOS 多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司生產(chǎn)），設(shè)定溫度為 4℃，孵育過(guò)夜，采用福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)的超敏S-P試劑盒，嚴(yán)格按使用說(shuō)明書(shū)操作，先后行DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。設(shè)置陰性對(duì)照，加入試劑為PBS（代替一抗）。

1.3 原位雜交實(shí)驗(yàn)

原位雜交的前期暴露mRNA的標(biāo)本處理同免疫組化檢查加入抗體前的操作步驟，預(yù)雜交溫度為40℃，預(yù)雜交時(shí)間為2 h，2 h后加入HIF－2α mRNA 探針（高辛標(biāo)記的多相寡核苷酸探針），探針序列依次為：（1）5''-CGAAC ACATA AACTC CTGTC TTCAG TGTGC-3''；（2）5''-ATCCG AGAGA ACCTG ACACT CAAAA CTGGC-3''；（3）5''-GGGCA AGTGA GAGTC TACAA CAACT GCCCC-3''。設(shè)定雜交溫度為38℃，時(shí)間為12 h，過(guò)夜后檢測(cè)雜交結(jié)果，檢測(cè)方法采用武漢博士德生物工程公司生產(chǎn)的原位雜交檢測(cè)試劑盒，操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。設(shè)置陰性對(duì)照，對(duì)照標(biāo)本在雜交實(shí)驗(yàn)中加入空白雜交液（代替探針）。

1.4 結(jié)果判斷與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

染色結(jié)果判斷，光學(xué)顯微鏡下觀察標(biāo)本背景顏色判斷染色結(jié)果，背影無(wú)明顯染色為陰性（-）；背景染色為淡黃色提示弱陽(yáng)性（+）；背景染色為黃色提示陽(yáng)性（++），背景染色為深黃色或棕色則提示為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。每位患者的切片標(biāo)本均選擇3條肺動(dòng)脈，觀察其染色情況，并進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)方法采用Ridit 分析及卡方檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織構(gòu)型觀察

COPD 患者肺部出現(xiàn)巨噬細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，肺泡隔纖維組織增生，支氣管壁增厚，肺部微動(dòng)脈管壁平滑肌層顯著增生，微血管管壁明顯增厚，導(dǎo)致管腔變窄。對(duì)照組患者肺組織標(biāo)本顯示除部分存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)外，肺血管、支氣管、微血管及官腔未見(jiàn)明顯異常。

2.2 HIF－2α mRNA表達(dá)

COPD 患者肺組織標(biāo)本染色顯示，肺部炎癥細(xì)胞、部分肺泡上皮細(xì)胞及部分肺動(dòng)脈壁細(xì)胞HIF－2α mRNA和蛋白質(zhì)染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，其余部位HIF－2αm RNA和蛋白質(zhì)染色均呈陽(yáng)性（圖2、4）。對(duì)照組患者肺組織標(biāo)本免疫組化及雜交試驗(yàn)顯示，HIF－2α mRNA染色弱陽(yáng)性，蛋白質(zhì)染色呈陰性，很少部分患者肺組織中肺泡上皮細(xì)胞及小部分肺動(dòng)脈壁HIF－2α mRNA 染色陽(yáng)性，蛋白質(zhì)染色呈弱陽(yáng)性（表1，圖1、3） 。

2.3 P-ERK、P-JNK、P-P38、P-Akt蛋白質(zhì)的表達(dá)

COPD 患者肺部部分肺動(dòng)脈壁細(xì)胞P-ERK蛋白質(zhì)染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，其余部位P-ERK蛋白質(zhì)染色均呈陽(yáng)性（表2，圖6），對(duì)照組大部分肺組織P-ERK染色呈陰性，部分肺泡上皮細(xì)胞及少量肺動(dòng)脈壁染色呈弱陽(yáng)性（表2，圖5）。COPD 患者肺部標(biāo)本組織免疫組化及雜交試驗(yàn)顯示，部分肺動(dòng)脈壁細(xì)胞P-Akt蛋白質(zhì)染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，其余部位P-Akt蛋白質(zhì)染色均呈陽(yáng)性（表3，圖12），對(duì)照組患者肺標(biāo)本免疫組化及雜交試驗(yàn)染色顯示，大部分肺組織P-Akt染色呈陰性，少量肺泡上皮細(xì)胞及小部分肺動(dòng)脈壁染色呈弱陽(yáng)性（表3，圖11）。COPD 患者肺部組織免疫組化及雜交試驗(yàn)染色顯示，部分肺動(dòng)脈壁細(xì)胞P-JNK，P-P38蛋白質(zhì)染色呈陰性，其余部位P-JNK、P-P38蛋白質(zhì)染色均呈弱陽(yáng)性（表2，圖8，10）。對(duì)照組患者肺部組織免疫組化及雜交試驗(yàn)染色顯示大部分肺組織P-JNK、P-P38染色呈陰性（表2，圖7，9），少量肺泡上皮細(xì)胞及小部分肺動(dòng)脈壁染色呈弱陽(yáng)性。

表1 肺動(dòng)脈HIF－1α基因表達(dá)水平比較

表2 肺動(dòng)脈P-ERK，P-JNK，P-P38表達(dá)水平比較

表3 肺動(dòng)脈P-PKB表達(dá)水平比較

注：表中數(shù)字為相應(yīng)染色結(jié)果的血管數(shù)量

3 討論

COPD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，目前普遍認(rèn)為COPD以氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為特征，在肺的不同部位有肺泡巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞（尤其是CD）和中性粒細(xì)胞增加，部分患者有嗜酸性粒細(xì)胞增多。激活的炎癥細(xì)胞釋放多種介質(zhì)，包括白三烯B4（LTB4）、白細(xì)胞介素8（1L-8）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和其他介質(zhì)。這些介質(zhì)能破壞肺的結(jié)構(gòu)和（或）促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)。除炎癥外，肺部的蛋白酶和抗蛋白酶失衡、氧化與抗氧化失衡以及自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂（如膽堿能神經(jīng)受體分布異常）等也在COPD發(fā)病中起重要作用。

本文研究顯示對(duì)照組患者肺組織少量肺泡上皮細(xì)胞及很少的肺動(dòng)脈壁HIF－2α mRNA陽(yáng)性、HIF－2α，P-ERK，P-Akt蛋白質(zhì)弱陽(yáng)性，其余肺組織HIF－2α mRNA 弱陽(yáng)性，HIF－2α、P-ERK、P-Akt蛋白質(zhì)陰性；COPD 患者肺部HIF－2α mRNA 及蛋白質(zhì)和P-ERK、P-Akt蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)，由此可見(jiàn)HIF－2α基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯以及P-ERK、P-Akt蛋白在COPD 患者肺組織內(nèi)均明顯增強(qiáng)或上調(diào)，這提示HIF－2 和P-ERK、P-Akt參與了COPD 的發(fā)病過(guò)程。COPD 患者氣流受限，導(dǎo)致的低氧血癥，肺泡通氣不足氧分壓下降及反應(yīng)性氣道狹窄肺泡通氣不均等因素可有效引發(fā)患者肺部HIF－2α蛋白質(zhì)和P-ERK、P-Akt表達(dá)增強(qiáng)。

動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明[5-10]，在缺氧條件下，P-ERK和P-Akt活化表達(dá)，可使HIF-2α中氧依賴性降解區(qū)內(nèi)氨基酸磷酸化，進(jìn)而增加HIF-2α的穩(wěn)定性，還可通過(guò)其磷酸化解除其翻譯調(diào)控蛋白EIF-4E的抑制因素，進(jìn)一步增加HIF-2α的翻譯、轉(zhuǎn)錄，間接促進(jìn)HIF-2α蛋白表達(dá)的增加。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，伴隨肺部P-ERK和P-Akt蛋白表達(dá)增加，對(duì)應(yīng)部位的HIF-2α蛋白表達(dá)也明顯增加，并且COPD患者肺動(dòng)脈管壁，P-Akt、P-ERK蛋白和HIF－2α表達(dá)均顯著增高，且同時(shí)顯微鏡觀察顯示COPD患者微動(dòng)脈平滑肌增厚，肺動(dòng)脈壁增厚、動(dòng)脈管腔變窄，由此可以得出P-ERK，P-Akt通過(guò)增加HIF－2α基因的表達(dá)而間接參與了COPD患者的肺血管重構(gòu)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]李啟芳，戴愛(ài)國(guó). 大鼠缺氧性肺動(dòng)脈高壓時(shí)三種缺氧誘導(dǎo)因子α亞基在肺動(dòng)脈中的差異表達(dá)[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2006，29（2）：113-117.

[2]李啟芳，戴愛(ài)國(guó). 慢性阻塞性肺疾病患者肺小血管低氧誘導(dǎo)因子-α的表達(dá)[J]. 中華內(nèi)科雜志，2006，45（2）：136-139.

[3]孔春初，戴愛(ài)國(guó)，胡瑞成. 磷酸肌醇3－激酶調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子1α對(duì)大鼠缺氧性肺動(dòng)脈高壓的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2006，22（11）：2132-2137.

[4]孔春初，戴愛(ài)國(guó). 絲裂原活化蛋白激酶調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子1α對(duì)大鼠缺氧性肺動(dòng)脈高壓的作用[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28（5）：328-332.

[5]Sally K. Martin， Peter Diamond， et al. Hypoxia-inducible factor-2 is a novel regulator of aberrant CXCL12 expression in multiple myeloma plasma cells[J]. Haematologica，2010，95（5）：776-784.

[6]Sascha Seidel，Boyan K. Garvalov et al. A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2[J]. Brain，2010，133（pt 4）：983-995.

[7]Julie M. Roda，Laura A. Sumner et al. Hypoxia-Inducible Factor-2α Regulates GM-CSF-Derived Soluble Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 Production from Macrophages and Inhibits Tumor Growth and Angiogenesis J[J]. Immunol Aug，2011，187（4）：1970-1976.

[8]Hye-Sik Kong，Sunmin Lee，Kristin Beebe，et al. Emetine Promotes von Hippel-Lindau-Independent Degradation of Hypoxia-Inducible Factor-2 in Clear Cell Renal Carcinoma[J]. Mol Pharmacol，2010，78（6）：1072-1078.

[9] Faten Bougatef，Cathy Quemener，Sabrina Kellouche，et al. EMMPRIN promotes angiogenesis through hypoxia-inducible factor-2-mediated regulation of soluble VEGF isoforms and their receptor VEGFR-2[J]. Blood， Dec，2009，114（27）：5547-5556.

[10]Samar Farha， Kewal Asosingh， Weiling Xu，et al. Hypoxia-inducible factors in human pulmonary arterial hypertension： a link to the intrinsic myeloid abnormalities[J].Blood，2011，117（13）：3485-3493.

（收稿日期：2012-05-15）