轉(zhuǎn)bar基因小麥大田篩選方法的建立及驗(yàn)證

張俊成　許甫超等

摘要：為在田間進(jìn)行有效的陽(yáng)性小麥轉(zhuǎn)基因植株的篩選，進(jìn)行了大田環(huán)境中篩選方法的研究。用粉劑和水劑２種不同類型草胺膦作為篩選劑，以無(wú)任何遮蓋、地膜覆蓋、簡(jiǎn)易小拱棚覆蓋和拱棚覆蓋４種處理，研究其在去除非轉(zhuǎn)基因植株上的效果差異。結(jié)果表明，采用水劑草胺膦比粉劑草胺膦在大田環(huán)境中更具有徹底殺滅的效果；４００ｍｇ／Ｌ的粉劑濃度和４００ｍｇ／Ｌ的水劑濃度在覆蓋地膜時(shí)均具有較好的篩選效果，粉劑低于該濃度則不能徹底殺滅；從小麥發(fā)育的４葉１心期到拔節(jié)期均可以作為篩選的時(shí)期；比較噴施后殺滅效果，加蓋拱棚＞加蓋簡(jiǎn)易小拱棚＞加蓋地膜＞無(wú)任何遮蓋，但加蓋拱棚會(huì)顯著增加小麥株高；篩選結(jié)果與ＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果一致。該研究建立并驗(yàn)證了一個(gè)大田篩選轉(zhuǎn)ｂａｒ基因小麥的方法，為小麥轉(zhuǎn)基因材料作為親本用于分子育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小麥；轉(zhuǎn)ｂａｒ基因；大田篩選方法；草胺膦

中圖分類號(hào)：Ｓ５１２．１；Ｑ７８９ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）24－5592-04

在轉(zhuǎn)基因小麥研究中，通常在轉(zhuǎn)化目的基因的同時(shí)連接一個(gè)選擇標(biāo)記基因用于對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的篩選。據(jù)報(bào)道，目前已有５０多種標(biāo)記基因用于轉(zhuǎn)基因研究，常用的選擇標(biāo)記基因主要有ｂａｒ基因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因［１，２］，其中，ＤＬ－ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ（ＰＰＴ）是轉(zhuǎn)基因小麥中常用的一種選擇劑，用于篩選含有ｂａｒ基因的轉(zhuǎn)基因植株。草胺膦抑制植物谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）活性，造成氮代謝失調(diào)和必需氨基酸的缺乏，導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)氨累積而中毒，而ｂａｒ基因編碼ＰＰＴ乙酰轉(zhuǎn)移酶（ＰｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎＮ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＰＡＴ），該酶可以使ＰＰＴ乙?；瑥亩梗校校詥适Ф拘裕郏?，４］。

以往對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的篩選，大多是采用涂抹法或在溫室條件下進(jìn)行［５－１０］，涂抹法在樣品較少情況下可以較易進(jìn)行，而對(duì)于單株數(shù)較多的育種材料來(lái)說(shuō)，則會(huì)急劇加大工作量；鑒于溫室條件如光照、溫度、濕度均可控制，在溫室條件下進(jìn)行噴施或涂抹也較易進(jìn)行，如果在開(kāi)放大田環(huán)境中用同樣的藥劑、條件和方法篩選轉(zhuǎn)基因植株，顯然會(huì)有較大難度。而進(jìn)行轉(zhuǎn)基因分子育種，就必須在田間對(duì)較多的后代材料進(jìn)行選擇，如果不能快速準(zhǔn)確地除掉不含目的基因的陰性單株，勢(shì)必會(huì)大大加重育種人員的負(fù)擔(dān)。

對(duì)于田間進(jìn)行大規(guī)模篩選含有目的基因的方法還鮮有報(bào)道。針對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行了小麥大田轉(zhuǎn)基因植株的篩選研究。根據(jù)楊逢玉等［３］影響植物吸收除草劑的關(guān)鍵因素是濕度、溫度和光照的研究結(jié)果，重點(diǎn)采取了保證溫度和濕度因素的措施，進(jìn)行了搭建拱棚、簡(jiǎn)易小拱棚和覆蓋地膜等對(duì)比試驗(yàn)，并研究了試劑濃度和小麥不同發(fā)育時(shí)期對(duì)除草劑吸收的影響，最終期望摸索出一種徹底、準(zhǔn)確殺死非轉(zhuǎn)基因后代的方法，為將轉(zhuǎn)基因材料應(yīng)用于育種奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

１ 材料與方法

１．１ 供試材料

轉(zhuǎn)高分子麥谷蛋白亞基基因１Ｄｘ５和選擇標(biāo)記基因ｂａｒ的小麥２－９６１５（５８－１６）和２－９６１７（ｗ１８－１１）由華中科技大學(xué)何光源教授提供。非轉(zhuǎn)基因小麥材料襄麥５５和“９００６８”為華中科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。所有材料于２０１１年１１月種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田，前茬水稻。

篩選劑采用Ｓｉｇｍａ公司草胺膦粉劑和永農(nóng)生物科技有限公司的草胺膦水劑（有效成分２００ｇ／Ｌ），分別稀釋到１００、１５０、２００、２５０、４００、６００ｍｇ／Ｌ備用。

１．２ 草胺膦噴施方法

處理方法：田間選取長(zhǎng)勢(shì)良好、整齊的樣地搭建拱棚、簡(jiǎn)易拱棚和覆蓋地膜。

噴施時(shí)期：從４葉１心期、５葉１心期、６葉１心期至拔節(jié)期噴施。

噴施方法：將草胺膦粉劑和水劑稀釋至不同濃度，均勻噴灑在小麥葉片上，直至葉片聚集液滴為止。在晴天正午或當(dāng)天溫度較高時(shí)噴施，有利于對(duì)草胺膦的吸收。噴施時(shí)使用擋板隔離相鄰的材料。試驗(yàn)以不噴施草胺膦為對(duì)照，以比較除草劑殺滅效果。噴施５ｄ后記錄葉片是否失綠變黃、萎蔫，６０ｄ后查看整個(gè)植株是否徹底死亡。

１．３ 驗(yàn)證方法

ｂａｒ基因ＰＣＲ擴(kuò)增方法采用張媛媛等［１１］的方法，１．５％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，引物序列由華大基因合成。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 不同篩選劑類型對(duì)小麥的殺滅效果差異

通過(guò)兩種除草劑對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，在相同濃度下，二者均能使不含ｂａｒ基因的小麥植株產(chǎn)生相應(yīng)毒害作用，只是粉劑的效果較為短暫，并不能起到完全殺死的作用；而水劑可以完全徹底殺滅非轉(zhuǎn)基因小麥，效果較明顯。

２．２ 不同處理對(duì)不同時(shí)期小麥殺滅效果的影響

由于在大田中使用粉劑草胺膦噴施后未采用任何措施以保證噴施后小麥葉片的溫度和濕度，使小麥表現(xiàn)出反應(yīng)較遲鈍，僅能使個(gè)別葉片黃化，之后可以恢復(fù)正常。試驗(yàn)比較了４種處理方式對(duì)非轉(zhuǎn)基因小麥殺滅效果的影響，分別是拱棚（高１．５ｍ）覆蓋、簡(jiǎn)易小拱棚（高４０.0ｃｍ）覆蓋、地膜覆蓋和無(wú)任何遮蓋處理。

２．２．１ 拱棚遮蓋處理 １２月１８日使用水劑草胺膦處理（１５０、２００、２５０ｍｇ／Ｌ），能夠徹底殺滅非轉(zhuǎn)基因小麥。噴施后，葉片受毒害反應(yīng)快，４～５ｄ即能表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象，６０ｄ后能夠全部死亡。

２．２．３ 地膜覆蓋處理 １月９日（６葉１心期）用水劑草胺膦２００、４００、６００ｍｇ／Ｌ處理，每個(gè)材料各噴施２行，留兩行不噴施做對(duì)照，噴施完覆蓋地膜。５ｄ后除２００ｍｇ／Ｌ濃度略有綠色外，其余濃度處理葉片均變黃，６０ｄ后２００ｍｇ／Ｌ濃度處理仍有幾株小麥存活，而其余濃度處理小麥均全部死亡。說(shuō)明４００ｍｇ／Ｌ或以上濃度在加蓋地膜情況下，可以徹底殺滅非轉(zhuǎn)基因小麥植株。

２．３ 大田直接噴施結(jié)果

為了探索不做任何遮蓋處理噴施水劑草胺膦對(duì)非轉(zhuǎn)基因小麥的殺滅效果，使用４００ｍｇ／Ｌ濃度噴施非轉(zhuǎn)基因材料后，50%采取覆蓋地膜處理，50%不做任何處理。結(jié)果覆蓋了地膜的小麥全部死亡，未做任何處理的小麥大部分也全部死亡，但是反應(yīng)時(shí)間較覆蓋地膜的小麥遲。

２．４ 不同處理對(duì)小麥生長(zhǎng)發(fā)育的影響

２．５ 超大劑量噴施草胺膦對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥的影響

為了考查過(guò)量使用除草劑對(duì)轉(zhuǎn)基因植株鑒定的影響，試驗(yàn)采用正常使用劑量的６.0倍和７．５倍處理含有ｂａｒ基因的小麥材料２－９６１５和２－９６１７。結(jié)果表明，噴施后植株基部老葉葉尖逐漸變黃，最終基部約３片葉死亡，但整個(gè)植株未受大的影響，仍能正常生長(zhǎng)，２０ｄ后即轉(zhuǎn)為正常狀態(tài)。說(shuō)明若過(guò)量施用了草胺膦，也不能殺死攜帶目標(biāo)基因的植株，從而不會(huì)影響后代選擇。

２．６ 篩選方法的驗(yàn)證

３ 討論

３．１ 最優(yōu)處理方式的確定

大田環(huán)境中溫度、濕度和光照隨天氣變化而變化，不利于植物對(duì)除草劑的吸收，從而影響了殺滅陰性材料的效果［３］。為確保對(duì)陽(yáng)性植株的選擇，在噴施除草劑后加蓋透明的覆蓋物，以達(dá)到保溫和保濕的目的。結(jié)果表明，加蓋的拱棚的高度越高，植株對(duì)除草劑的反應(yīng)越快，但同時(shí)對(duì)植株的株高影響也越大。只有覆蓋地膜對(duì)植株高度無(wú)影響，同樣能夠達(dá)到較好的選擇效果，同時(shí)覆蓋地膜的方法簡(jiǎn)單易行，所用成本也較低，又能確保徹底殺滅陰性植株，因此建議采用噴施草胺膦后覆蓋地膜而無(wú)需搭建拱棚。此外，水劑草胺膦殺滅效果顯著優(yōu)于粉劑草胺膦，而且成本也非常低。

３．２ 不同基因型和發(fā)育時(shí)期對(duì)草胺膦吸收的影響

就基因型而言，研究采用非轉(zhuǎn)基因小麥材料和轉(zhuǎn)基因材料各兩個(gè)，噴施前期的反應(yīng)略有差異，如葉色黃化程度，與武麗敏等［１２］的結(jié)果一致，但到后期基本無(wú)較大變化。因此，非轉(zhuǎn)基因小麥和轉(zhuǎn)基因小麥的不同基因型對(duì)除草劑的適用性沒(méi)有較大影響。就葉齡或發(fā)育時(shí)期而言，從４葉１心期到拔節(jié)期均進(jìn)行了不同濃度的試驗(yàn)，并未發(fā)現(xiàn)對(duì)草胺膦反應(yīng)遲鈍時(shí)期，說(shuō)明這些時(shí)期均可進(jìn)行草胺膦篩選試驗(yàn)。值得注意的是，拔節(jié)期后植株株高明顯增高，不利于覆蓋地膜，建議最好在拔節(jié)期前進(jìn)行噴施。

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