激素法與液氮法在兔股骨頭壞死造模中的應(yīng)用比較研究

王蕭楓 吳銀生 王利明(等）

[摘要] 目的 分析比較激素法與液氮法在股骨頭壞死動物模型的應(yīng)用。 方法 30只兔隨機分為3組，A組為單純激素注射組，兔子每周2次臀肌注射醋酸潑尼松龍，每次8 mg/kg，連續(xù)6周；B組為用液氮將股骨頭冷凍壞死；C組為空白對照組。對一般形態(tài)學(xué)、影像學(xué)MRI、組織病理學(xué)等進行觀測。 結(jié)果 A、B兩組股骨頭均出現(xiàn)缺血性壞死表現(xiàn)，空骨陷窩率較對照組明顯增高（P < 0.01），并且3周時A組空骨陷窩率明顯低于B組（P < 0.01），6周時A組與B組空骨陷窩率無明顯差異（P > 0.05）。A組兔全身藥物反應(yīng)明顯，骨壞死修復(fù)晚且能力差，且骨陷窩空虛率隨時間延長而增加（P < 0.01）。B組兔造模所需時間短，骨修復(fù)反應(yīng)大，隨著實驗觀察時間延長，骨壞死程度是進行性減輕（P < 0.01）。 結(jié)論 通過單純激素或液氮冷凍股骨頭均可建立兔非創(chuàng)傷性缺血性壞死動物模型， 前者較適合于病因、病理方面或者綜合性研究；后者更適合于標(biāo)準(zhǔn)化治療的研究。

[關(guān)鍵詞] 股骨頭壞死；激素；液氮；疾病模型

[中圖分類號] R681.8[文獻標(biāo)識碼] A[文章編號] 1673—9701（2012）25—0018—03

The comparative application of hormonal method and liquid nitrogen method in modeling of femoral head necrosis in rabbits

WANG Xiaofeng1 WU Yinsheng1 WANG Liming2 MAO Qiang2 JIN Hongting2

1.Department of Orthopedics， Hospital of the Integration of Traditional Chinese and Western Medicine， Wenzhou 325000， China； 2.Fractures Research Institute， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China

[Abstract] Objective To compare hormonal methods and liquid nitrogen method of vascular necrosis of the femoral head （ANFH）. Methods All 30 rabbits were randomly divided into three groups， Group A was taken simple hormone injection， prednisolone acetate 8 mg/kg i.m twice a week was administrated for 6 weeks；Group B was established by improved liquid nitrogen frozen method；Group C was the control group. The general morphology， imaging MRI， histopathology and other were observed. Results A， B groups were successful modeling， the rate of empty lacunae in the hormone， A and B groups were obviously increased more than that of control group at 3 weeks or 6 weeks after model preparation（P < 0.01）， group A of empty lacunae was significantly lower than that of group B at 3 weeks （P < 0.01）， and there was no significant difference at 6 weeks（P > 0.05）. Compared with group B， rabbits of A group were more systemic drug reactions， bone necrosis later and poor repair， and the rate of empty lacunae lacunae increased with time prolonged （P < 0.01）， and the osteonecrosis degree of group B was progressively alleviate with the experimental observation time （P < 0.01）. Conclusion The model of ANFH disease can be built up by steroid and serum injection or liquid nitrogen in rabbits. The former is more suitable for the cause， pathology， or a comprehensive study；the latter is more suitable for standardized therapy.

[Key words] Femur head necrosis；Steroids；Liquid nitrogen；Disease models

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）的發(fā)病率近年來正在逐漸增加，其病理過程復(fù)雜，病因及發(fā)病機理尚未完全明了，治療方法也多種多樣，治療方法的選擇及其療效還存在很大爭議[1]。建立理想的NONFH動物模型，是研究其病因及發(fā)病機制十分重要的手段，也是進行治療研究的基礎(chǔ)。激素法與液氮法均是NONFH模型中最常見的方法之一，但二者的致骨壞死機制顯然不同，本研究旨在觀察兩種造模法后動物生存狀態(tài)及病理改變，為建立NONFH模型研究中提供更理想的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康成年新西蘭大白兔30只，雌雄各半，體重（2.5±0.3） kg。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供[合格證號： SYXK（浙）2008—0116]。飼養(yǎng)條件相同，實驗過程中對動物處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。隨機分成三組： A組（激素組，n = 10）、B組（液氮冷凍組，n = 10）、C組（空白對照組，n = 10）；動物適應(yīng)1 周后開始實驗。

1.2 方法

A組參照國內(nèi)賀氏造模法[2]，對造模兔子每周2次臀肌注射醋酸潑尼松龍，每次8 mg/kg，連續(xù)6周，同時每周2次肌肉注射青霉素鈉4萬U/和雷尼替丁針25 mg以預(yù)防感染與消化道潰瘍。B組參照改良Takaoka造模法[3]，采用30 mg/kg戊巴比妥鈉耳靜脈麻醉，嚴(yán)格按照無菌操作原則進行手術(shù)，取左髖關(guān)節(jié)外側(cè)切口，分離軟組織，切開關(guān)節(jié)囊，不剪斷圓韌帶與股骨頭脫位，用漏斗將股骨頭頸套住，紗布保護周圍組織，將液氮20 mL倒入漏斗內(nèi)，冰凍3 min，50℃溫鹽水復(fù)溫，多方位重復(fù)3次，逐層縫合切口，術(shù)后青霉素4萬U肌肉注射（肌注），2次/周。C組為空白對照組，對CA組5只兔每周2次臀肌注射生理鹽水5 mL，其他處置與A組相同；對CB組5只兔除了未用液氮冷凍外，其他處置均與B組相同。

1.3 觀察指標(biāo)

①一般形態(tài)學(xué)觀察每周稱體重1次，觀察并記錄動物毛發(fā)光澤度、食量、大小便、活動度、步態(tài)精神狀況等變化；②影像學(xué)觀察于造模第3、6周末行雙側(cè)股骨頭MRI攝片，觀察有無軟骨及軟骨下骨質(zhì)信號改變。③組織病理學(xué)觀察于造模第3、6周末，各組分別處死一半兔子，并取材股骨頭，觀察外觀、質(zhì)地，關(guān)節(jié)軟骨色澤、外形等。病理切片HE染色，光鏡觀察骨組織、骨髓組織變化、骨組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化等。光學(xué)顯微鏡10×40倍視野下隨機選取10個高倍鏡視野，數(shù)出總骨陷窩和空骨陷窩數(shù)，空骨陷窩率=平均空骨陷窩數(shù)/平均總骨陷窩數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件包進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用配對t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般形態(tài)學(xué)觀察

在試驗期內(nèi)，A組兔從第2周開始出現(xiàn)精神萎靡懶動，毛色漸失光澤，第3周出現(xiàn)毛發(fā)蓬松易脫落、少食、消瘦、皮下脂肪顯著減少，并呈逐漸加重趨勢，有些兔子出現(xiàn)腹瀉；到第5周時可觀察到大部分兔出現(xiàn)站立困難，跛行等現(xiàn)象。至6周末A組體重平均較造模前下降了31.26%；幸存的兔子精神狀態(tài)及體重趨于穩(wěn)定。B組兔術(shù)后切口均一期愈合，大部分傷口縫線自行脫落，無發(fā)生髖關(guān)節(jié)脫位、腹瀉等現(xiàn)象，第1周時有左髖部畏動，進食量偏少，第3周時可見左髖活動減少，但全身情況良好，無毛色失光、易脫落、消瘦等現(xiàn)象，至第6周基本恢復(fù)正常，體重?zé)o明顯變化。C組所有兔體重保持穩(wěn)定，甚至稍微增加，精神良好，機靈活潑。

2.2 影像學(xué)觀察

實驗3、6周時所有實驗動物蛙式正位X片示雙側(cè)股骨頭均無明顯變化，A組3周時MRI檢查有6個股骨頭（4只）關(guān)節(jié)面下有透亮區(qū)或密度增高，表現(xiàn)為壞死區(qū)在T1WI上為中低信號，在T2WI上呈較高信號，周圍環(huán)繞線樣低信號，6周時有14個股骨頭（8只） 現(xiàn)關(guān)節(jié)囊內(nèi)有條狀水樣信號，雙側(cè)股骨頭信號不均勻，新月狀透亮影，關(guān)節(jié)間隙變窄，周圍軟組織略有腫脹（圖1）；B組3周時MRI檢查有10個股骨頭（10只）關(guān)節(jié)面下表現(xiàn)為股骨頭脂肪高信號中出現(xiàn)不同形態(tài)的低信號區(qū)，呈環(huán)形、帶狀和灶狀，6周時9個股骨頭（9只）關(guān)節(jié)面下有透亮區(qū)（圖2）；C組所有股骨頭無明顯變化。

2.3 組織病理學(xué)觀察

A組：股骨頭壞死隨時間的推移而加重，第3周時的大部分兔股骨頭表面色澤較灰暗，并有關(guān)節(jié)軟骨變薄及部分剝脫，骨質(zhì)松脆；第6周時易于剖開切鑿，剖斷面有油膩樣變，提示有骨質(zhì)疏松，脂肪變性。切片HE染色：軟骨下骨部分變薄，松質(zhì)骨區(qū)出現(xiàn)典型骨壞死灶，骨小梁稀疏萎縮，甚至有斷裂現(xiàn)象；骨內(nèi)小血管病變，有血栓形成；骨髓細(xì)胞溶解壞死，碎屑聚集、基質(zhì)溶解，造血組織及紅骨髓明顯減少；髓腔內(nèi)大量脂肪細(xì)胞聚集，數(shù)量增多、直徑增大，部分融合成泡狀；骨小梁周沿隱約可見梭形成骨細(xì)胞，但數(shù)量很少；骨細(xì)胞核固縮、崩解，空骨陷窩多見且密集，有骨組織弱修復(fù)反應(yīng)（圖3）。

B組：股骨頭壞死隨時間推移而骨修復(fù)反應(yīng)明顯，第3周時所有股骨頭的軟骨出現(xiàn)剝脫，軟骨下骨暴露，骨質(zhì)硬化，關(guān)節(jié)軟骨下有較多破骨細(xì)胞聚集，骨小梁變細(xì)，出現(xiàn)折痕或吸收現(xiàn)象；第6周時骨陷窩空虛減少，骨小梁附加骨和新生類骨質(zhì)較多（圖4）。

C組：股骨頭骨質(zhì)堅硬光滑，不易剖開切鑿。光鏡下股骨頭軟骨下骨小梁完整，排列規(guī)則整齊，骨細(xì)胞清晰可見，核位于中央，且較大。成骨細(xì)胞沿骨小梁成串分布，有散在的空骨陷窩。骨髓造血細(xì)胞豐富，脂肪細(xì)胞相對較少。

2.4 造模3、6周時各組的骨陷窩率比較

A、B兩組造模3、6周時的骨陷窩率與C組比較，差異分別有統(tǒng)計學(xué)意義（△P < 0.05、△△P < 0.01，*P < 0.01、**P < 0.01）；A組造模3周時的骨陷窩率與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），而造模6周時，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

表1 造模3、6周時各組的骨陷窩率比較（x±s）

3 討論

通過動物模型復(fù)制人類疾病是醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的重要途徑之一， 在探討疾病的病因、 發(fā)病機制及防治方法的選擇與改進方面均具有重要作用。近30年來，國內(nèi)外學(xué)者對NONFH動物模型的建立進行了許多研究，遺憾的是，到目前為止仍難于模擬出人NONFH的自然病理過程和人NONFH軟骨下骨塌陷的臨床特征[4]。創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機制已經(jīng)明確，而非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機制尚未完全明了，但所有股骨頭缺血性壞死的病理變化是一致的，即骨細(xì)胞壞死和隨后的修復(fù)反應(yīng)[5]。目前國內(nèi)外報道股骨頭壞死動物模型的建立方法有很多，最常應(yīng)用的是激素法誘導(dǎo)或液氮冷凍制作股骨頭壞死動物模型。激素法包括單純激素模型、血清加激素模型、內(nèi)毒素加激素模型，液氮法包括液氮冷凍與液氮注射法等。

采用單純激素模型和液氮冷凍模型進行比較分析，發(fā)現(xiàn)單純醋酸潑尼松龍肌注可以成功誘導(dǎo)兔激素性股骨頭壞死動物模型，并通過行預(yù)防性抗生素與制酸劑的應(yīng)用，可以減少動物死亡率。而改良Takaoka法建立了液氮冷凍股骨頭壞死，操作中不剪斷圓韌帶，不脫位股骨頭，通過各種角度旋轉(zhuǎn)來顯露股骨頭不同的負(fù)重面，進行反復(fù)交替液氮冷凍、復(fù)溫，避免復(fù)位后無法有效維持復(fù)位狀態(tài)，一方面影響動物活動，另一方面也難證實是液氮冷凍導(dǎo)致股骨頭壞死還是脫位創(chuàng)傷造成股骨頭壞死。兩者的骨壞死模型均獲得MRI與組織病理學(xué)的證實。

但兩者模型在諸多方面有所不同，在全身情況方面，A組兔模會出現(xiàn)全身庫欣氏綜合征即皮質(zhì)醇增多癥的表現(xiàn)，如精神萎靡，毛色及皮膚失去正常光澤，肌肉萎縮，機體免疫力下降，易感染。出現(xiàn)股骨頭壞死后可表現(xiàn)下肢運動明顯受限，站立困難，跛行。A組中從第3周起陸續(xù)出現(xiàn)上述的一般表現(xiàn)，6周后大部出現(xiàn)運動明顯受限，站立困難，跛行等現(xiàn)象；B組兔模生存狀況良好，無生理擾亂現(xiàn)象。在影像學(xué)觀察方面，A組兔模在3周時僅6個股骨頭（4只）、6周時有14個股骨頭（8只） 出現(xiàn)MRI信號不均勻，新月狀透亮影，關(guān)節(jié)間隙變窄，周圍軟組織略有腫脹等炎癥水腫表現(xiàn)；B組3周時MRI檢查有9個股骨頭（9只）關(guān)節(jié)面下有透亮區(qū)，6周時有10個股骨頭（10只）關(guān)節(jié)面下表現(xiàn)為股骨頭脂肪高信號中出現(xiàn)不同形態(tài)的低信號區(qū)，呈環(huán)形、帶狀和灶狀。在骨壞死方面，A組兔模出現(xiàn)骨壞死較晚，雖存在個體耐受差異性現(xiàn)象，但隨著實驗時間延長呈現(xiàn)進行性加重。且多為廣泛壞死，其修復(fù)晚且能力差[6]，提示病因復(fù)雜、綜合性的骨壞死，骨修復(fù)反應(yīng)微小。B組兔模出現(xiàn)骨壞死較早，通過液氮冷凍直接使股骨頭內(nèi)的骨細(xì)胞壞死并使血管形成血栓進一步阻斷股骨頭內(nèi)的血循環(huán)，可以造成所有實驗股骨頭壞死，同時隨后的骨修復(fù)反應(yīng)大，隨著實驗觀察時間延長骨壞死程度是進行性減輕。實驗的可控性較好[7]。

因此，我們認(rèn)為在骨壞死模型研究中，激素法與液氮法應(yīng)該根據(jù)實驗的實際需要加以選擇。由于激素法造成的骨壞死發(fā)病機制復(fù)雜，有脂質(zhì)代謝紊亂、血管內(nèi)凝血、骨內(nèi)高壓、血管損傷、血液黏度增高、骨質(zhì)疏松等病理改變，是全身綜合征下的局部股骨頭壞死，較適合于病因、病理方面或者綜合性研究；液氮冷凍不同于化學(xué)方法造成的壞死， 對動物全身無毒副作用，造模所需時間短，模型壞死成功率高，可重復(fù)性強，可作為模擬臨床手術(shù)清除死骨、植骨治療研究的動物模型，較其他方法制備的模型更適合于標(biāo)準(zhǔn)化治療的研究。

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（收稿日期：2012—03—22）