牛奶中黃曲霉毒素M₁檢測方法研究進展

黃曲霉毒素M₁(AflatOxin M1，AFMD是黃曲霉毒素中一種二氫呋喃雜萘鄰?fù)苌?，主要是由于奶牛食用了被黃曲霉毒素B1(Aflatoxln B1，AFBI)污染的飼料后，AFB，在奶牛體內(nèi)代謝產(chǎn)生的羥基化代謝物，轉(zhuǎn)化反應(yīng)式如圖1。AFMM₁毒性強、對人體危害大，1993年WHO將AFM，歸為對人類||類致癌物，其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，主要危害的部位在肝臟。

AFM₁很難降解，其熔點(裂解溫度)為299℃對光、熱和酸都比較穩(wěn)定。牛奶加工常用的三種熱處理方法

巴氏殺菌法(LTLT，63℃保持30min)、高溫快速巴氏殺菌(HTST，72℃保持15s)和超高溫滅菌(UHT，135℃保持1～2s)均不能破壞其毒性。因此，生鮮乳中存在的AFM₁會導(dǎo)致乳制品中也含有AFM₁。許多國家、國際組織依據(jù)本國國情制定了牛奶中AFM₁的限量標準，并就AFM₁的檢測方法開展了許多研究工作。本文對不同國家、國際組織對牛奶中AFM₁限量值進行了比對分析，并重點對其檢測方法進行了綜述，以期對我國奶業(yè)生產(chǎn)者和政府監(jiān)管部門起到定借鑒作用，切實保證我國牛奶中的AFM₁安全。牛奶中AFM₁的限量

AFM₁限量的確定是法律法規(guī)制定和風(fēng)險控制的關(guān)鍵內(nèi)容。牛奶中AFM₁限量取決于科學(xué)、社會和經(jīng)濟方面的諸多因素，主要包括危害分析、暴露分析結(jié)果、抽樣方案和方法、分析方法、貿(mào)易協(xié)調(diào)、國內(nèi)食品供應(yīng)6因素。這些因素都能制約AFM₁限量值的確定，其中危害分析和暴露分析是風(fēng)險評估內(nèi)容，是風(fēng)險評估中最重要的部分：抽樣方案、方法和分析方法是確定限量值的實驗手段，是獲得真實數(shù)據(jù)的保證：貿(mào)易協(xié)調(diào)和國內(nèi)食品供應(yīng)是社會經(jīng)濟因素。這些因素相互影響。制約，綜合地決定牛奶中AFM，限量值。

截至2004年底，已有60個國家制定了AFM₁的限量值。牛奶中AFM₁限量值采用0.05g／kg的國家最多，為34個其中絕大部分國家是歐盟成員國以及與歐盟有貿(mào)易的非洲、亞洲、拉丁美洲部分國家，歐盟對嬰幼兒配方食品，包括嬰幼兒配方牛奶限量0.025ug／kg。另個限量值為0.5ug／kg，有22個國家，包括美國、中國以及若干亞洲和歐洲國家。還有4個國家分別采用15、5、0.2“g／kg以及不得檢出。一些主要國家牛奶中AFMI的限量標準見表1。飼料中黃曲霉毒素含量過高。發(fā)霉的谷物作為飼料飼喂奶牛后，24小時后便可在奶中檢出AFM₁。由于飼料原料很容易出現(xiàn)黃曲霉毒素污染，尤其是玉米和花生，因此目前各個國家對飼料中的黃曲霉毒素B₁，以及牛奶中的黃曲霉毒素M₁都有所限量，卻不能要求完全不可檢出。黃曲霉毒素被奶牛食用后，一部分會蓄積在動物的體內(nèi)，另一部分則會轉(zhuǎn)化到乳汁和尿液中。因此，為了保證牛奶中的黃曲霉毒素M₁不超過0.5g／kg，美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)規(guī)定飼料中的黃曲霉毒素B₁不得超過30g／kg。我國GB 13078-2001《飼料衛(wèi)生標準》對飼料中的黃曲霉毒素B，限量也有著嚴格要求，見表2。

牛奶中AFM₁的檢測方法

牛奶中A FM₁的檢測程序

般包括樣品的制備、AFM₁的提取、提取物的凈化和最終的定性、定量測定。牛奶中AFM₁的定量定性分析方法主要有薄層色譜分析法(ThinLayer Ch romatog raphy,TLC)、高效液相色譜法(High Performance LiquidChromatography,HPLC)、液相色譜質(zhì)譜法(Liquid Chromatog raphy with MassSpectrometry，LC MS)和快速法。

1TLC法

TLC法是通過肉眼比較定性或者半定量的檢測方法。樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，AFMI在波長365nm的紫外光下產(chǎn)生藍紫色熒光，根據(jù)其在薄層板上顯示熒光的最低檢出量與標準溶液的熒光強度相比較來測定含量。

TLC法是牛奶中黃曲霉毒素M，測定的官方規(guī)定方法之，GB 5009，242010食品中黃曲霉毒素M1和B，的測定、ISO 14674：2005(1DF 190：2005)牛奶和奶粉黃曲霉毒素M₁的測定、AOAC974.17乳制品中黃曲霉毒素M₁的測定和AOAC 980 21牛奶和奶酪黃曲霉毒素M₁的測定就是TLC法。隨著HPLC和LC-MS的發(fā)展，TLc應(yīng)用程度有所下降，但由于其不依賴特殊儀器，成本低、操作簡單快速，仍被用于大規(guī)模的篩查研究中。

2HPLC法

HPLC法利用免疫親和柱或C1 8柱凈化后，HPLC串聯(lián)不同檢測器，如熒光(Fluo rescence Detection，F(xiàn)LD)、質(zhì)譜(MassSpectrometry，MS)等的定量測定被廣泛用于牛奶中AFM₁的檢測。

(1)HPLCFLD

用c18柱抽提純化樣品中的AFM，乙醚對c18柱洗滌，再用CH2C12醇洗脫AFM₁，然后加入三氟乙酸(TFA)對AFMI進行衍生化處理，利用液相色譜熒光檢測器檢測，并與標準AFM₁-TFA的衍生物比較，進行定性、定量分析。此法利用了牛奶中AFM，具有較強的發(fā)射熒光特性，具有靈敏性高、選擇性強、價格經(jīng)濟、易于操作優(yōu)點。我國GB 5413 37201 0乳和乳制品中黃曲霉毒素M，的測定(第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法)、GB／T 2321 2 2008牛奶和奶粉中黃曲霉毒素B1、B、G1、G、M1和M：的測定，XAOAC 2000，。8液態(tài)奶黃曲霉毒素M1含量的測定采用的就是LC FLD或HPLC FLD法。

(2)HPLC MS

由于AFMl的分離和檢測條件致，電噴射(Efficient_lectrospray，ESl)、大氣壓化學(xué)電離(Atmospheric PressureChemical lonlzatlon，APCI)等技術(shù)應(yīng)用于LC MS，質(zhì)譜分析儀器領(lǐng)域的發(fā)展等

原因，MS檢測器具有更高的選擇性、對分析物分子標識的確證、可用同位素標記作為內(nèi)標等優(yōu)勢，HPLC MS廣泛應(yīng)用于AFM1的檢測中。ISO 14501：2007IDF171：2007)牛奶和奶粉黃曲霉毒素M1含量的測定和我國GB 5413.37-201 乳和乳制品中黃曲霉毒素M，的測定(第法免疫親和層析凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法)采用的就LC MS法檢測奶中的黃曲霉毒素M₁。

3

快速法

快速法又稱掃描法，是定性或半定量方法。定性的閾值是限量值，各國不同?，F(xiàn)場快速的檢測對于質(zhì)量安全監(jiān)管具有重要的意義。酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme Linked lmmuno SorbentAssay，剛SA)、單克隆抗體試劑盒法、雙流向酶聯(lián)免疫吸附法(SNAP)、膠體盒法等半定量技術(shù)無需對牛奶進行前處理，檢測時間短、操作方法簡單且不依賴于任何儀器，被廣泛地應(yīng)用于牛奶，尤其是生乳的檢測中。

(1)ELISA法

ELISA法原理是：樣品中的AFMI與定量特異性抗體反應(yīng)，多余的游離抗體與酶標板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，加入酶標記物和底物后顯色，與標準比較來測定含量。該方法靈敏度高，特異性強，檢測結(jié)果穩(wěn)定準確，實驗操作污染少，一次實驗可檢測多個樣品。該方法靈敏度高、易操作，可用于現(xiàn)場檢測。

對于乳及乳制品中AFMl的檢測，我國DB33／T 556 2005乳和乳粉中黃曲霉毒素M₁的測定使用酶聯(lián)免疫吸附法和ISO 14675：2003(1DFl86：2003)牛奶和牛奶制品競爭酶聯(lián)免疫分析的標準化描述指南黃曲霉毒素M，含量的測定即為ELISA法。

(2)單克隆抗體試劑盒法

單克隆抗體試劑盒是一種建立在以單克隆抗體技術(shù)與ELISA技術(shù)的基礎(chǔ)上，針對原料奶中黃曲霉毒素M₁，的快速檢測的試劑盒，該方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等特點。

(3)膠體金法

此法基于競爭法膠體金免疫層析技術(shù)，用于快速篩查含有AFM₁的液態(tài)奶、奶粉(含嬰兒奶粉)和飼料等樣品。將檢測樣品液加入速測卡上的樣品孔，檢測液中的AFM₁與金標卡上的金標抗體結(jié)合形成復(fù)合物，若AFM₁在檢測液中濃度低于設(shè)定檢測靈敏度值(陰性樣本)，未結(jié)合的金標抗體流到T區(qū)時，被固定在膜上的抗原捕獲，形成條可見的T線；若AFM，濃度高于設(shè)定檢測靈敏度值，金標抗體即與AFMl全部形成復(fù)合物，不再與T線處抗原結(jié)合，T線不可見。C線為質(zhì)控線，出現(xiàn)則說明該速測卡有效。

(4)SNAP法

利用酶聯(lián)免疫競爭原理，樣品中殘留的黃曲霉毒素M₁與定量特異性酶標抗體反應(yīng)，多余的游離酶標抗體則與酶標板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，通過流動洗滌，加入酶顯色底物顯色后，與標準點比較定性。GB 5413.372010乳和乳制品中黃曲霉毒素M₁的測定(第四法)和NY 1664-2008牛乳中黃曲霉毒素M₁的測定均采用此法?？偨Y(jié)

近年來，由于多級質(zhì)譜(Multistage Mass Spectrometry，MS)的發(fā)展，HPLC-MS／MS法可對牛奶中多種霉菌毒素同時進行檢測，且無須衍生化。該法預(yù)處理簡單、檢測速度快、靈敏度高的優(yōu)點，可適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中多組分霉菌毒素的確認和準確定量檢測。此外，乳及乳制品特別是生乳的貯存條件特殊，不宜長時間運輸貯存，快速檢測對大規(guī)模監(jiān)測具有重要意義。同時，快速的現(xiàn)場檢測可以提高檢測效率，加大監(jiān)測范圍和力度，保證牛奶質(zhì)量安全。但快速法篩選出的陽性或超標樣品需要HPLC法、HPLC-MS法等定量法的進

步確證。

(基金項目：農(nóng)業(yè)國際合作與交流項目資助；通訊作者：鄭楠)