脂肪間充質干細胞促進皮膚創(chuàng)面修復及其作用機制探討

朱桂英 柴家科

大面積深度燒傷以及慢性難愈性創(chuàng)面修復一直是臨床治療的難點。隨著干細胞研究的開展和深入，體內外實驗證明位于皮下脂肪組織內的脂肪干細胞[1]（adipose-derived stem cells, ADSCs）可以有效促進皮膚創(chuàng)面愈合。皮膚創(chuàng)面愈合[2]是一個復雜的多因素過程，涉及炎癥反應、細胞增殖、細胞遷移、再上皮化、血管生成、細胞外基質沉積以及重塑等多方面。在創(chuàng)傷條件下，傷口滲液和其中的炎性因子以及有絲分裂原等趨化因子促進ADSCs增殖，向傷口遷移[3]。實驗證明，ADSCs在體、內外均可以向皮膚表皮細胞、成纖維細胞和血管內皮細胞等多種細胞分化，分泌多種生物活性分子限制炎癥和凋亡、促進血管形成、促進創(chuàng)周組織細胞，參與損傷修復等，最終實現(xiàn)促進創(chuàng)面愈合的作用。

1脂肪干細胞的生物學特性以及低免疫原性

ADSCs是成體間充質干細胞的一種，廣泛分布于不同物種，如人、鼠、豬、犬及兔等不同部位的脂肪組織中。其數(shù)量巨大，1g脂肪組織可以產生大約5×103脂肪干細胞，大約是1g骨髓中獲取干細胞數(shù)量的500倍；取材安全簡便，在局麻下即可獲取大量細胞，體外擴增和自我更新能力很強；可以向多種細胞系分化：脂肪、骨、軟骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、內皮、肝細胞、造血細胞以及神經元細胞[4-5]，ADSCs是真正意義上的具有多向分化潛能的干細胞。ADSCs具有間充質干細胞這一類細胞的特異性表面標記[6]， 表達大量的粘附分子：ADSCs持續(xù)性表達CD9、整合素β1(CD29)和α4 (CD49d)、細胞間粘附分子1 (ICAM-1，即CD54)、CD105、血管細胞粘附分子(VCAM，即CD106)和活化淋巴細胞粘附分子(ALCAM，即CD166)，表達Ⅰ類組織相容性蛋白HLA-ABC。ADSCs不表達造血細胞表面標志CD14、CD34或CD45，不表達Ⅱ類組織相容性抗原HLA-DR及內皮細胞標志CD31，不表達共刺激因子B7-1（CD80）、B7-2（CD86）和CD40。ADSCs表面標記物會隨著培養(yǎng)時間的延長而有所改變。早期原代培養(yǎng)的ADSCs (也稱為stromal vascular fraction, SVF)中存在造血干細胞以及內皮祖細胞的標志分子， 如：CD11a、CD14、CD45、CD86、HLA-DR。自第2代以后，ADSCs均勻一致地表達間充質干細胞特有標記：CD13、CD29、CD44、CD73、CD90，這可能與原代培養(yǎng)的ADSCs含有多種細胞成分有關[7-8]。人ADSCs不表達MHC2 Ⅱ類分子和B7-1（CD80）、B7-2（CD86）和CD40等共刺激分子，這些分子是效應性T細胞激活所必需的，共刺激分子的缺乏，使得T細胞活化的第二信號喪失，導致Th 細胞的無反應性而促成免疫耐受，表現(xiàn)出低免疫原性。

2ADSCs向表皮細胞、成纖維細胞分化，促進創(chuàng)面皮膚再上皮化

脂肪干細胞具有定向分化為組織修復所需要的終末分化細胞的能力，為組織修復以及構建組織工程皮膚提供充足的細胞來源。在體外將ADSCs定向誘導分化為表皮細胞的方法較多。雷永紅等[9]采用皮膚勻漿液處理ADSCs，單獨培養(yǎng)或與熱休克損傷的HEKa細胞共培養(yǎng)，誘導rADSCs向表皮細胞定向分化表達CK10、CK14、CK19，其誘導分化效率高于單純使用表皮生長因子EGF。王先成等[10]利用EGF以及維甲酸等成分誘導ADSCs分化，10天后細胞出現(xiàn)鋪路石改變，細胞表達CK19。這與Brzoska等[11]的實驗相一致，ADSCs在全反式維甲酸誘導作用下向上皮細胞分化，表達上皮細胞早期的表面標記-角蛋白CK18，不再表達波形蛋白（vimentin）等間充質干細胞標志。Ebrahimian [12]則是將ADSCs在角質細胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，發(fā)現(xiàn)ADSCs向角質形成細胞分化，表達K5和K14。

干細胞在局部微環(huán)境的影響下定向誘導分化為創(chuàng)傷部位的靶細胞，該現(xiàn)象稱為局部專一分化（site-specific differentiation）[13]。在體實驗[14-15]以真皮基質或者蠶絲蛋白-殼聚糖支架（SFCS）作為載體，將GFP標記人ADSCs與之形成的復合物移植到裸鼠背部，移植后2周發(fā)現(xiàn)GFP-ADSCs分化為成纖維細胞，表達熱休克蛋白HSP47；移植后4周GFP-ADSCs分化成表皮細胞，表達CK19。Nie等[16-18]利用脫細胞真皮支架作為載體或者采用創(chuàng)周皮內注射的方式將ADSCs應用于創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)ADSCs分化為表皮細胞，表達pan角蛋白、CK5和CK14。

3向血管內皮細胞和平滑肌細胞分化，分泌促進血管生成因子

Cao 等[18]利用體外實驗，將ADSCs在體外與VEGF共培養(yǎng)時可以表達血管內皮細胞ECs標志。雷永紅[19]應用30%大鼠血管勻漿液誘導大鼠ADSCs 3天，細胞向血管內皮細胞分化，表達CD34和血管性假血友病因子vWF。楊平等[20]應用TGF-β1、PDGF-BB體外誘導ADSCs，細胞呈現(xiàn)明顯的血管平滑肌細胞VSMCs特性，表達血管平滑肌蛋白α-SMA、SM-MHC以及Calponin。體內實驗將ADSCs直接或者以支架為載體應用到皮膚創(chuàng)面后，發(fā)現(xiàn)GFP-ADSCs向血管內皮細胞分化，表達SMA、vWF[14-15]或者CD31[16-17]。分泌血管原性生成因子如VEGF、HGF、FGF2、TGFβ3，促進肉芽組織生長和新生血管形成，增加血管密度，增加隨意皮瓣的血流供應[21]，提高全厚皮膚移植的成活率[22]，促進生理性和病理性創(chuàng)面愈合。

4旁分泌作用，增強組織修復

單獨使用ADSC分泌的細胞因子即條件培養(yǎng)液ADSC-CM有助于調節(jié)局部細胞對創(chuàng)傷的反應，促進創(chuàng)面愈合。皮膚損傷波及到脂肪組織時，會釋放FGF-2，激活JNK通路，促進ADSCs增殖和分泌，促進血管形成以及促進細胞分裂，促進組織再生，減輕組織纖維化[23]。ADSCs[24-25]可以分泌大量促進血管生成和抗凋亡的細胞因子： VEGF，粒系/巨噬細胞系集落刺激因子M-CSF，基質來源因子SDF-1α，HGF，IGF-1，KGF以及FGF-2。ADSCs分泌產生KGF不受輻射的影響[12]。外源性的細胞因子對ADSCs的分泌功能具有一定的促進作用。TNF-α促進ADSCs分泌的IL-6和IL-8，在體內皮膚傷口模型加速傷口愈合、血管形成、增殖、免疫細胞浸潤中起主要作用[26]。胰島素[27-28]后的ADSCs-CM含有更高水平的VEGF和HGF，有效促進人血管內皮細胞增殖、遷移并抑制其凋亡，有利于組織血管化。動物創(chuàng)傷模型顯示，ADSCs-CM中的TGF-β1[29]通過增加透明質酸酶HAS-1以及HAS-2表達，促進透明質酸合成；ADSCs-CM還可以上調細胞外基質Ⅰ、Ⅲ型膠原、纖連蛋白的mRNA水平，下調MMP-9的mRNA水平，增強HDF分泌Ⅰ型膠原，刺激膠原合成和成纖維細胞遷移，在體內促進傷口愈合。局部注射ADSCs到糖尿病缺血模型創(chuàng)面[30]，提高血漿和組織中VEGF的含量，明顯縮小創(chuàng)面面積，局部新生血管增加，加快愈合速度，改善創(chuàng)面愈合后質量。Valerie等[31]利用ADSCs、自體角質形成細胞以及自體成纖維細胞或者新生兒包皮成纖維細胞構建組織工程皮膚，呈現(xiàn)表皮、真皮以及皮下組織三層結構，不需要任何合成的或者外源的支架材料，且這種三層結構的皮膚替代物可以分泌TGF-β、VEGF、KGF和bFGF，具有創(chuàng)傷修復更強的潛力。

5促進細胞增殖和遷移作用

ADSCs可以通過細胞接觸或者旁分泌作用促進臨近組織細胞的增殖和遷移，有效提高創(chuàng)面的愈合速度。Kim等[32]發(fā)現(xiàn)ADSCs通過共培養(yǎng)、transwell培養(yǎng)方式均可以促進人真皮成纖維細胞（HDF）增殖以及遷移；ADSCs經TGF-β1 [33]處理后對皮膚成纖維細胞的遷移作用增強；胰島素[28]則具有促進ADSCs對血管內皮細胞的遷移作用，增加新生血管形成；鼠源ADSCs與細胞直接接觸共培養(yǎng)后促進人表皮角質細胞（HEKa）分裂增殖和遷移[34]。

6低氧增強ADSCs的創(chuàng)面修復作用

在影響ADSCs功能的眾多因素中，周圍環(huán)境中的氧氣濃度特別是低氧環(huán)境發(fā)揮了重要作用。缺氧[35]通過活化ADSCs細胞膜的受體酪氨酸激酶，接著磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）以及Akt信號通路成員，缺氧誘導因子1a（HIF-1a）明顯增加， ADSCs分泌更多抗凋亡和促進血管生成的生物活性物質：胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBP-1）、IGFBP-2、M-CSF、M-CSFR、血小板來源生長因子PDGFR-beta、VEGF、 bFGF、HGF、IGF、瘦素leptin、血管生成素-2、Bcl2、BclxL，促進細胞生長，減少細胞凋亡。其中VEGF的轉錄是誘發(fā)血管生成級聯(lián)反應的關鍵步驟。

在20%、5%、1%氧濃度下，ADSCs分泌的VEGF的表達進行性增高。ADSCs具有向SDF-1遷移的能力，低氧可以上調ADSCs表面的SDF-1受體趨化因子受體CXCR4的表達，促進ADSCs的遷移；低氧還促進ADSCs的增殖，發(fā)揮再生潛力[36]。在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的ADSC條件培養(yǎng)液hypoCM與正常氧濃度下的norCM相比較，VEGF和bFGF的mRNA和蛋白表達增加，促進膠原合成和真皮成纖維細胞遷移，加速創(chuàng)面愈合[37-38]。低氧環(huán)境下的ADSC-CM促進毛囊毛乳頭細胞以及表皮角質形成細胞增殖，誘導毛發(fā)進入生長期，促進毛發(fā)再生[39]。

7安全、無致瘤性

ADSCs[40-41]在實驗室中經過長期傳代或凍存仍然保持干細胞特征，增殖分化能力無改變，仍可以保留其免疫原性，無明顯的免疫學特性改變和分化傾向。陳光平等[42]研究證實ADSCs在體外進行增殖分化過程中，其端粒酶活性以及染色體核型未發(fā)生異常變化。ADSCs應用于皮膚傷口，局限于損傷局部，沒有向全身擴散，不會影響機體遠位腫瘤的擴大和惡化[43]。向免疫缺陷小鼠靜脈內注射2.5×108細胞/kg體重，小鼠存活且無副作用。向Balb/c-nu裸鼠靜脈內注射2.0×108細胞/kg體重，觀察26周無腫瘤發(fā)生。在人體臨床試驗，向8名脊髓損傷超過12個月的男性患者單次注射4.0×108細胞，隨訪3個月無嚴重副作用發(fā)生。全身應用ADSCs顯然是安全的，不會誘導腫瘤發(fā)生[44]。

綜上所述，ADSCs具有多向分化潛能，促進新生血管形成，加速創(chuàng)面愈合。相對于骨髓干細胞，ADSCs來源于低氧環(huán)境，有助于耐受細胞移植后短暫的營養(yǎng)匱乏期[45]。治療所用的ADSCs來自患者自身的脂肪，因此，有望在不引起任何免疫排斥的情況下修復受損組織。ADSCs來源充足，易于分離，安全無致瘤性，是用于自體干細胞移植治療的最佳細胞來源。

8問題與展望

既往ADSCs促進皮膚創(chuàng)面愈合的相關實驗研究均采用的是同種異體或者異種ADSCs經過體外誘導或者純化后,直接應用或者以各種支架為載體移植到創(chuàng)面，來觀察ADSCs的治療作用；創(chuàng)面模型均采用的是皮膚切除模型。目前,尚無將ADSCs應用到燒傷創(chuàng)面的相關實驗報道,但是燒傷創(chuàng)面有別于皮膚切除，有著其獨特的病理過程，燒傷創(chuàng)面的微環(huán)境與ADSCs的相互影響規(guī)律是什么？干細胞用于燒傷創(chuàng)面治療的時機？轉歸如何？燒傷后，位于燒傷創(chuàng)面基底的脂肪組織中的大量的ADSCs，是否被啟動參與到燒傷創(chuàng)面的修復中？相信隨著ADSCs的基礎和臨床應用研究的不斷深入，ADSCs必將成為皮膚創(chuàng)傷特別是燒傷創(chuàng)面修復的最佳細胞來源。

[參考文獻]

[1]Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells [J].Mol Biol Cell,2002,13(12):4279-4295.

[2]Gurtner GC,Werner S,Barrandon Y,et al.Wound repair and regeneration [J].Nature,2008,453:314-21.

[3]Scherzed A,Hackenberg S,Froelich K,et al.The effect of wound fluid on adipose-derived stem cells in vitro:a study in human cell materials [J].Tissue Eng Part C Methods,2011,17(8):809-817.

[4]Gimble JM,Katz AJ,Bunnel BA.Adipose-derived stem cells for regenerative medicine [J].Circ Res,2007,100(9):1249-1260.

[5]Fraser JK,Wulur I,Alfonso Z,et al.Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology [J].Trends Biotechnol,2006,24:150-154.

[6]Gronthos S,Franklin DM,Leddy HA,et al.Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells[J].J Cell Physiol,2001,189(1):54-63.

[7]McIntosh K,Zvonic S,Garrett S,et al.The Immunogenicity of Human Adipose Derived Cells: Temporal Changes In Vitro [J].Stem Cells,2006,24:1246-1253.

[8]Mitchell JB,Mcintosh K,Zvonic S,et al.Immunogenicity of Human Adipose-Derived Cells: Temporal Changes In Stromal-Associated and Stem Cell-Associated Markers [J].Stem Cells,2006,24:376-385.

[9]雷永紅,付小兵, 盛志勇,等.誘導脂肪干細胞向表皮細胞表型的轉分化研究[J].中華整形外科雜志,2007,3(23): 151-153.

[10]王先成,喬 群,管利東,等.人脂肪間充質干細胞生物學特征及向體外類角質細胞的分化[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(37):7333-7336.

[11]Brzoska M,Geiger H,Gauer S,et al.Epithelial differentiation of human adipose tissue-derived adult stem cells [J].Biochem Biophys Res Commun,2005,330:142-150.

[12]Ebrahimian TG,Pouzoulet F,Squiban C,et al.Cell therapy based on adipose tissue-derived stromal cells promotes physiological and pathological wound healing [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2009,29(4):503-510.

[13]Liechty KW,Mackenzie TC,Shaaban AF,et al.Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep [J].Nat Med,2000,6:1282-1286.

[14]Altman AM,Matthias N,Yan Y,et al.Dermal matrix as a carrier for in vivo delivery of human adipose-derived stem cells [J].Biomaterials,2008,29(10):1431-1442.

[15]Altman AM,Yan Y,Matthias N,et al.IFATS collection: Human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model [J].Stem Cells,2009,27(1):250-258.

[16]Nie C,Yang D,Morris SF.Local delivery of adipose-derived stem cells via acellular dermal matrix as a scaffold: a new promising strategy to accelerate wound healing [J].Med Hypotheses,2009,72(6):679-682.

[17]Nie C,Yang D,Xu J,et al.Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis [J].Cell Transplant,2011,20(2):205-216.

[18]Cao Y,Sun Z,Liao LM,et al.Human adipose tissue-derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo [J].Biochem Biophys Res Commun,2005,332:370-379.

[19]雷永紅，付小兵, 盛志勇,等. 誘導脂肪干細胞向血管內皮細胞分化的實驗研究[J].中華外科雜志,2010,48(14): 1106-1110.

[20]楊 平,尹 爍,崔 磊,等.脂肪干細胞向血管平滑肌細胞誘導的實驗研究[J].中國修復重建外科雜志,2008,22(4):481-486.

[21]Lu F,Mizuno H,Uysal CA,et al.Improved viability of random pattern skin flaps through the use of adipose-derived stem cells [J].Plast Reconstr Surg,2008,121(1): 50-58.

[22]Zoqrafou A,Tsiqris C,Papadopoulos O,et al.Improvement of skin-graft survival after autologous transplantation of adipose-derived stem cells in rats [J].J Plast Reconstr Aesthet Surg,2011,64(12): 1647-1656.

[23]Saqa H,Eto H,Shiqeura T,et al.IFATS Collection: Fibroblast growth factor-2-induced hepatocyte growth factor secretion by adipose-derived stromal cells inhibits postinjury fibrogenesis through a c-Jun N-terminal kinase-dependent mechanism [J].Stem Cells,2009,27(1):238-249.

[24]Rehman J,Traktuev D,Li J,et al.Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells [J].Circulation,2004,109:1292-1298.

[25]Meliga E,Strem BM,Duckers HJ,et al.Adipose-derived cells [J]. Cell Transplant,2007,16(9): 963-970.

[26]Heo SC,Jeon ES,Lee IH,et al.Tumor necrosis factor-a-activated human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing through paracrine mechanisms [J].J Invest Dermatol,2011,131(7):1559-1567.

[27]折 濤, 胡大海, 張彥剛, 等. 胰島素干預后脂肪干細胞旁分泌對人血管內皮細胞的作用[J]. 中華燒傷雜志,2011,27(1):32-36.

[28]折 濤,胡大海,張 軍,等. 胰島素對脂肪干細胞旁分泌功能的影響[J].中華燒傷雜志,2009,25(4): 268-271.

[29]Jung H,Kim HH,Lee DH,et al.Transforming growth factor-beta 1 in adipose derived stem cells conditioned medium is a dominant paracrine mediator determines hyaluronic acid and collagen expression profile [J].Cytotechnology,2011,63(1): 57-66.

[30]Kim EK,Li G,Lee TJ,et al.The effect of human adipose-derived stem cells on healing of ischemic wounds in a diabetic nude mouse model [J].Plast Reconstr Surg,2011,128(2): 387-394.

[31]Trottier V,Marceau-Fortier G,Germain L,et al.IFATS Collection: Using Human Adipose-Drived Stem/Stromal Cells for the Production of New Skin Substitutes [J].Stem Cells,2008,26(10):2713-2723.

[32]Kim WS,Park BS,Sung JH,et al.Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts [J].J Dermatol Sci,2007,48(1):15-24.

[33]Cho JW,Kang MC,Lee KS. TGF-β1-treated ADSCs-CM promotes expression of type 1 collagen and MMP-1, migration of human skin fibroblasts, and wound healing in vitro and in vivo [J].Int J Mol Med,2010,26(6): 901-906.

[34]袁 方,雷永紅,付小兵,等.脂肪干細胞促進人表皮角質形成細胞創(chuàng)面模型愈合的研究[J].中華外科雜志,2008,10(46):1575-1579.

[35]Zachar V,Duroux M,Emmersen J,et al.Hypoxia and adipose-derived stem cell-based tissue regeneration and engineering [J].Expert Opin Biol Ther,2011,11(6):775-786.

[36]Thangarajah H,Vial IN,Chang E,et al.IFATS collection: adipose stromal cells adopt a proangiogenic phenotype under the influence of hypoxia [J].Stem Cells,2009,27(1):266-274.

[37]Lee EY,Xia Y,Kim WS,et al.Hypoxia-enhanced wound-healing function of adipose-derived stem cells: increase in stem cell proliferation and up-regulation of VEGF and bFGF [J]. Wound Repair Regen,2009,17(4): 540-547.

[38]Chung HM,Won CH,Sung JH.Responses of adipose-derived stem cells during hypoxia: enhanced skin-regenerative potential [J].Expert Opin Biol Ther,2009,9(12):1499-1508.

[39]Park BS,Kim WS,Choi JS,et al.Hair growth stimulated by conditioned medium of adipose-derived stem cells is enhanced by hypoxia: evidence of increased growth factor secretion [J].Biomed Res,2010,31(10): 27-34.

[40]Rodriquez AM,Elabd C,Amri EZ,et al.The human adipose tissue is a source of multipotent stem cells [J]. Bilchimie,2005,87(1):125-128.

[41]Liu G,Zhou H,Li Y,et al.Evaluation of the viability and osteogenic differentiation of cryopreserved human adipose-derived stem cells [J].Cryobiology,2008,57(1):18-24.

[42]陳光平,羅盛康,徐 翔,等.人脂肪干細胞體外增殖的安全性評價[J].廣東醫(yī)學院學報,2009,27(2):126-129.

[43]Altman AM,Prantl L,Muehlberg FL,et al. Wound microenvironment sequesters adipose-derived stem cells in a murine model of reconstructive surgery in the setting of concurrent distant m alignancy [J].Plast Reconstr Surg,2011,127(4):1467-1477.

[44]Ra JC,Shin IS,Kim SH,et al.Safety of intravenous infusion of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in animals and humans[J].Stem Cells Dev,2011,20(8):1297-1308.

[45]Follmar KE,Decroos FC,Prichard HL,et al.Effects of glutamine, glucose, and oxygen concentration on the metabolism and proliferation of rabbit adipose-derived stem cells [J].Tissue Eng,2006,12(12): 3525-3533.

[收稿日期]2011-12-10 [修回日期]2012-02-06

編輯/李陽利