二去水衛(wèi)矛醇和二乙酰二去水衛(wèi)矛醇抗腫瘤作用的研究進展*

申雅娟 ，鄧楠 ，丁輝 ，張麗娟 ，宋新波 ，楊建會

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天士力集團有限公司，天津 300402）

近年來腫瘤發(fā)病率越來越高，但尚未發(fā)現(xiàn)十分有效的治療藥物，嚴(yán)重威脅人類健康，所以發(fā)現(xiàn)更有效的腫瘤治療藥物尤為重要。二去水衛(wèi)矛醇（DAG）其化學(xué)名稱為 1，2∶5，6-二脫水半乳糖醇，是一種活性較好的抗腫瘤藥。根據(jù)DAG的藥物效應(yīng)動力學(xué)及藥物代謝動力學(xué)特性——對多種腫瘤細胞有較好的抑制作用，又可以透過血腦屏障作用于腦腫瘤，將DAG制成其前體藥物以降低其毒性是有必要的。因此學(xué)者們合成大量DAG衍生物以探究其抗腫瘤活性，其中應(yīng)用最廣泛的是二乙酰二去水衛(wèi)矛醇（DADAG）。研究發(fā)現(xiàn)在已糖醇中，DADAG的毒性最小；DADAG比DAG脂溶性大，更易透過血腦屏障[1-2]；DADAG對多種腫瘤也有抑制作用。因此本文就DAG和DADAG的合成、抗腫瘤作用及其機制、聯(lián)合用藥進行綜述。

1 DAG和DADAG的合成

Shirota等[3]以從衛(wèi)矛科美登木屬植物Maytenus ebenifolia的干燥莖皮分離得到的衛(wèi)矛醇為原料，在溴酸溶液中進行溴代反應(yīng)得到二溴衛(wèi)矛醇（DBD），DBD和碳酸鉀在叔丁醇中發(fā)生分子內(nèi)消除反應(yīng)得到DAG粗品，經(jīng)重結(jié)晶得到DAG純品，代霖霖等[4]對其工藝進行了優(yōu)化，最終產(chǎn)品純度>97.0%，并適合放大生產(chǎn)。賴樹生等[5]探索出了工藝操作簡單、生產(chǎn)成本低廉的DADAG合成方法，其純度達到了99.1%。

2 DAG和DADAG的抗腫瘤作用

關(guān)于DAG和DADAG的抗腫瘤作用，運用最早的是治療白血病。20世紀(jì)初，國內(nèi)治療慢性粒細胞白血病首選藥是白消安片，但它會引起血小板減少、肺纖維化、閉經(jīng)等不良反應(yīng)。DAG治療白血病作用較白消安片快，且對白消安片有抗藥性的患者換用此藥也有一定的療效[6-7]，臨床應(yīng)用總緩解率>80%[6-7]。鑒于其在治療白血病方面突出的醫(yī)療價值，有學(xué)者研究了DAG對人腦腫瘤細胞IMR-32、人肺癌細胞H460、人肝癌細胞BEL-7404、人胃癌細胞SGC-7901、人鼻咽癌細胞CNE、卵巢癌細胞A2780的體外抑制作用，72 h后半數(shù)抑制濃度分別為24.28、15.98、16.73、16.00、4.12 和 15.15 μg/mL[8-10]。吳余燕等[11]研究了DADAG對人肺癌細胞A549、人肝癌細胞HepG2、人胃癌細胞MGC、人鼻咽癌細胞HNE-1作用48 h后半數(shù)抑制濃度分別為 47.75、28.52、141.29和49.36 μg/mL。由此可見，DAG和DADAG在抑制腦腫瘤、肝癌、肺癌、鼻咽癌及卵巢癌等方面也有療效。

3 DAG和DADAG抗腫瘤作用機制

腫瘤是一類細胞增殖、分化異常的疾病，藥物治療腫瘤的理論依據(jù)在于促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的生長繁殖及轉(zhuǎn)移和促進腫瘤細胞的分化。腫瘤的增生過程中，也必然伴隨一個毛細血管網(wǎng)為其提供足夠的氧和營養(yǎng)物質(zhì)，如果可以抑制毛細血管網(wǎng)的生長，也可以抑制腫瘤的生長[12]。

3.1 促進腫瘤細胞凋亡 細胞凋亡是由體內(nèi)外因素誘導(dǎo)細胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序被激活而導(dǎo)致細胞死亡的過程，又稱細胞程序性死亡。凋亡伴隨的外在變化主要是細胞形態(tài)的改變，內(nèi)在變化則涉及多條信號通路。已發(fā)現(xiàn)DAG和DADAG涉及到的凋亡通路有線粒體通路、P53通路和拓撲異構(gòu)酶Ⅱ介導(dǎo)通路。

3.1.1 線粒體通路 當(dāng)細胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)后，細胞內(nèi)凋亡信號會引起線粒體途徑的凋亡。作為凋亡誘導(dǎo)因子的細胞色素C由線粒體外膜通過線粒體通透性轉(zhuǎn)換（PT）孔釋放到細胞質(zhì)中，經(jīng)過一系列途徑激活半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）等因子，導(dǎo)致聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）斷裂為具有生物活性的片段，具有DNA切割作用，最終導(dǎo)致細胞凋亡[13]。線粒體通路主要由B淋巴細胞瘤（Bcl）-2家族蛋白控制，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能差異將其分為3類，一類為Bcl-2亞家族，具有抗凋亡作用，如Bcl-2、Bcl-xL等；一類為Bcl-2相關(guān)的X基因（Bax）家族，通常可以促進凋亡，如Bax等；一類為BH3-only亞家族，同樣可以促進凋亡，如Bcl-xL/Bcl-2相關(guān)死亡促進因子（Bad）等。其中，促凋亡蛋白Bax等能使線粒體PT孔開放，促進線粒體凋亡途徑的激活；而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl等則誘導(dǎo)PT孔關(guān)閉，抑制線粒體途徑的細胞凋亡。BH3-only蛋白（如Bad）可以和激活后的Bax定位至線粒體中，通過抑制Bcl-2/xL蛋白，促進線粒體途徑的細胞凋亡。蘇桂玉等[14]將DAG作用于人小細胞肺癌細胞NCI-H1299，研究發(fā)現(xiàn)促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)，Caspase-3被激活。吳余燕等[15]研究了DADAG對肺癌NCI-H460細胞株的作用，發(fā)現(xiàn)Bcl-2表達減少，Bax表達增加，說明DADAG和DAG可以通過對Bcl-2和Bax蛋白進行調(diào)節(jié)，激活線粒體凋亡通路，實現(xiàn)其抗腫瘤作用。楊錦南等[16]通過對DADAG作用于人急性早幼粒白血病HL-60細胞株的實驗發(fā)現(xiàn)，隨著處理時間的延長和DADAG濃度的增高，Bcl-2、Bcl-xL基因下調(diào)的趨勢也更顯著，Bad蛋白水平明顯上調(diào)，說明DADAG也可以作用于Bad蛋白，激活線粒體凋亡通路。

3.1.2 P53通路 P53是腫瘤抑制蛋白，對Bcl-2蛋白家族有重要調(diào)節(jié)作用。經(jīng)研究表明P53蛋白可以直接激活Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax，從而促進Caspase級聯(lián)反應(yīng)，促進細胞凋亡。另外，P53還可作為轉(zhuǎn)錄因子促進凋亡蛋白的表達[17]。P53是沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）的底物之一，與SIRT1結(jié)合后，使其C端的賴氨酸殘基脫乙?；?，導(dǎo)致P53失活[18]。周瑩[19]在裸鼠體內(nèi)研究了DAG對人NCIH460肺癌細胞誘導(dǎo)凋亡的機制，發(fā)現(xiàn)促細胞凋亡因子P53、Bax表達量增加，抑凋亡因子Bcl-2的表達減少。Xiao等[20]研究發(fā)現(xiàn)DAG以劑量依賴的方式降低了SIRT1、Bcl-2蛋白的表達，增加了P53、Caspase-3、Bax等蛋白的表達，說明DAG可以促進P53通路介導(dǎo)的細胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)展。

3.1.3 拓撲異構(gòu)酶Ⅱ介導(dǎo)的通路 黃銀妹[21]通過研究DAG對人肺癌細胞NCI-H460的作用，發(fā)現(xiàn)DAG能明顯促進NCI-H460細胞的凋亡，作用機制研究表明DAG能降低Topo Ⅱ mRNA和蛋白水平，說明DAG可能有Topo Ⅱ抑制劑樣作用，其可能作用于DNA、拓撲異構(gòu)酶和Topo Ⅱ-DNA可切割復(fù)合物，來影響DNA的斷裂和再連接反應(yīng)，干擾DNA復(fù)制，導(dǎo)致細胞凋亡[22]。

3.2 抑制腫瘤細胞增殖 腫瘤是細胞增殖異常而形成的腫塊，所以抑制腫瘤細胞增殖、阻滯腫瘤細胞周期可以控制腫瘤的發(fā)展。

3.2.1 抑制腫瘤細胞增殖 DAG對核酸合成前體物質(zhì)有明顯的抑制作用，從而阻礙了白血病細胞DNA和RNA的合成，使細胞的增殖也受到干擾[23]。

3.2.2 阻滯腫瘤細胞周期于G2/M期 細胞周期是由1組稱為周期素（Cyclin）的蛋白和1組依賴于周期素的蛋白激酶（CDK）來調(diào)控的。引起G2期向M期轉(zhuǎn)變的一個關(guān)鍵性物質(zhì)是Cdc2/Cyclin Bl活性復(fù)合體[M期啟動因子（MPF）]。Cdc2蛋白的磷酸化狀態(tài)與其活性相關(guān)，其第14、15位的氨基酸去磷酸化會激活Cdc2，反之會抑制Cdc2激酶活性。細胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（Cdc25C）可以水解Cdc2第14、15位的磷酸基團，從而激活Cdc2蛋白。而另一種細胞周期調(diào)節(jié)蛋白Wee1可將Cdc2第14、15位的磷酸基團磷酸化，使Cdc2蛋白失活[24]。當(dāng)DNA雙鏈斷裂時，可以通過磷酸化Cdc25C，加速Cdc25C的泛素化降解，阻滯MPF激活[25]。Zhai等[26]發(fā)現(xiàn)DAG可導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，不可逆地阻滯細胞周期于G2/M期，促進腫瘤細胞凋亡。Zhang等[27]研究DADAG對人肝癌細胞QGY-7703的增殖抑制作用，檢測到Cyclin B1在細胞內(nèi)聚集，但Cdc2蛋白表達下降，M期啟動因子活性受到抑制，導(dǎo)致G2/M期細胞周期阻滯。Peng等[28]研究DAG對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株LN229、U251、U87MG的作用，發(fā)現(xiàn)DAG通過抑制Cdc25C蛋白的表達，在G2/M期誘導(dǎo)細胞周期阻滯，發(fā)揮其抗腫瘤作用。閆雪蓮等[29]通過實驗研究DADAG對人前列腺癌PC-3M細胞內(nèi)鳥氨酸脫羧酶（ODC）活性的影響，結(jié)果顯示DADAG可降低ODC的活性，同時檢測到周期相關(guān)蛋白CyclinB1、Wee1等蛋白的表達增加，Cdc25C的表達降低，細胞周期阻滯于G2/M期。但是，ODC活性降低，抑制多胺的合成，而多胺對細胞周期也有調(diào)節(jié)作用，其與周期相關(guān)蛋白表達之間是否存在因果關(guān)系還有待探討。

3.2.3 阻滯腫瘤細胞周期于G1/S期 P21蛋白是CDK的抑制劑，通過干擾細胞周期蛋白來調(diào)節(jié)細胞周期，抑制細胞從G1期到S期的轉(zhuǎn)變[30-31]。DNA損傷后，通過一系列調(diào)節(jié)減輕P53的抑制或降解，導(dǎo)致P53的穩(wěn)定和激活?；罨腜53可通過刺激P21的表達參與細胞周期抑制。Zhai等[32]研究DAG對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株的作用，發(fā)現(xiàn)DAG通過激活P53-P21信號級聯(lián)，在G1/S期誘導(dǎo)細胞周期阻滯，發(fā)揮抗腫瘤作用。

3.3 抑制腫瘤細胞的遷移、侵襲 腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移過程非常復(fù)雜，主要受細胞外基質(zhì)（ECM）降解、細胞黏附分子等多個因素的影響?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMP）和尿激酶型纖溶酶原激活因子（uPA）等對ECM均具有廣泛的降解作用，能促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。將DAG作用于膠質(zhì)母細胞瘤和HepG2腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)DAG可以通過抑制MMP2、MMP-9和uPA因子的表達來抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，抑制腫瘤患者復(fù)發(fā)、病情惡化[20，33]。

3.4 抑制腫瘤血管的生成 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一類能夠調(diào)節(jié)血管生成的因子，包括VEGF-A等，VEGF受體是酪氨酸激酶受體家族，包括 了 VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3。 VEGF-A 和VEGFR2結(jié)合可以促進血管生長，是VEGF正調(diào)控的主要通路[34]。SP1能通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）磷酸化反應(yīng)，誘導(dǎo)肺癌細胞VEGF的表達[35]。劉敬弢等[36]研究DADAG對小鼠H22移植瘤的作用，發(fā)現(xiàn)DADAG可以降低小鼠腫瘤質(zhì)量和腫瘤組織中微血管密度（MVD），與血管生成的相關(guān)蛋白VEGF及SP1的表達量明顯減少。Jiang等[33]研究發(fā)現(xiàn)DAG在體外和斑馬魚模型中均能抑制腫瘤血管生成，機制研究發(fā)現(xiàn)是通過抑制VEGF/VEGFR2和成纖維細胞生長因子（FGF）2/FGFR1信號通路抑制血管生成。

3.5 其他途徑 自噬是腫瘤細胞對抗各種抗腫瘤作用的有效手段，通過降解受損腫瘤細胞的細胞器、大分子蛋白質(zhì)，為腫瘤細胞提供生物合成所需的分子底物，幫助其應(yīng)對惡劣的生存環(huán)境并維持細胞穩(wěn)態(tài)。特別是在腫瘤化療過程中，自噬能夠通過隔離并降解被藥物破壞的蛋白質(zhì)或細胞器，保護腫瘤細胞，降低化療藥物的療效[37-40]。Zhang等[41]采用DAG處理C6大鼠膠質(zhì)瘤細胞，發(fā)現(xiàn)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC）3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，P62表達增加，說明DAG可以通過抑制細胞自噬途徑控制腫瘤的發(fā)展。

4 聯(lián)合用藥

DAG（周期非特異性藥）與美登新（周期特異性藥）同時或間隔24 h給藥對艾氏腹水瘤小鼠的生命延長有協(xié)同作用，不同先后順序給藥對白血病L1210細胞也有協(xié)同作用，應(yīng)用DAG后24 h再予美登新，對B16黑色素瘤質(zhì)量抑制有協(xié)同作用，聯(lián)合用藥對肝癌細胞HEPA及S180沒有協(xié)同作用[42]。DAG和長春新堿（VCR）聯(lián)合使用對小鼠淋巴細胞白血病L1210有協(xié)同療效，對小鼠骨髓干細胞也有微弱的協(xié)同殺滅作用[43]。同時給藥DAG和阿糖胞苷（AraC），或先予DAG，均有明顯的協(xié)同療效。DAG和甲氨蝶呤（MTX）先后給藥對小鼠白血病L1210細胞也有協(xié)同作用，尤其是先予DAG，生命延長率達193.1%[44]。替莫唑胺與DAG聯(lián)合用藥，可以增強療效[45]。使用DAG和射線結(jié)合對多形性成膠質(zhì)細胞瘤患者治療效果明顯，且DAG能夠增加腫瘤細胞對放療的敏感性[46]。DADAG與抑癌基因P53聯(lián)合作用于人肝癌細胞BEL-7404，有明顯協(xié)同作用[47]。

5 小結(jié)與展望

目前，腫瘤發(fā)病率逐年上升，臨床治療尚無特效藥物，已有的治療方式如放化療對人體損傷很大，尋找更有效、更安全的治療藥物迫在眉睫，而DAG和DADAG均具有較好的抗腫瘤活性，且DAG和DADAG是多靶點藥物，涉及到多條信號通路調(diào)控，影響腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移及其周圍毛細血管網(wǎng)的生成，進而發(fā)揮抗腫瘤作用，說明DAG與DADAG有較高的研究價值。雖然已有研究涉及白血病、肝癌、肺癌和腦腫瘤等多種腫瘤疾病，且療效較好，但其抗腫瘤作用機制并沒有完全闡明，臨床應(yīng)用較少，尤其是對DADAG的研究更少，可以展開更深入的機制研究和臨床研究，挖掘其更大的臨床價值。臨床上對于腫瘤的治療不僅局限于采用DAG、DADAG單獨用藥或聯(lián)合用藥，同時也可以結(jié)合基因治療、放療等方法，以期有更好的治療效果，需要更深一步研究。