傳染性法氏囊病病毒PY05株的分離鑒定

盧佳 張宇耕 崔保安 李新生 劉媛媛 陳禮鵬 岳旭龍 王俊亞

摘要：為了分離到雞傳染性法氏囊?。ǎ桑睿妫澹悖簦椋铮酰?ｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅ，ＩＢＤ）病毒，從河南省濮陽(yáng)地區(qū)某疑似感染雞法氏囊病病毒的雞場(chǎng)采集病料，用ＳＰＦ雞胚對(duì)病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增ＶＰ４片段對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示該毒株能引起雞胚規(guī)律性死亡，且出現(xiàn)ＣＡＭ增厚、雞胚出血等明顯病變；待檢抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清之間出現(xiàn)陽(yáng)性沉淀線；瓊脂電泳得到大小約為１ ２００ｂｐ片段，與預(yù)期結(jié)果相符。結(jié)果證明該分離株為ＩＢＤＶ地方株，并命名為ＰＹ０５株。

關(guān)鍵詞：雞傳染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）；分離；鑒定

中圖分類號(hào)：Ｓ８５８．３１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：１００７－２７３Ｘ（２０12）04-0009-02

雞傳染性法氏囊病（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ，ＩＢＤ）是由雞傳染性法氏囊病病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ，ＩＢＤＶ）引起的雞的急性、高度接觸性、殺淋巴細(xì)胞性傳染病［１］。該病主要侵害３～１２周齡幼雞，以損傷雞的法氏囊為主要特征，使雞群產(chǎn)生嚴(yán)重、長(zhǎng)期的免疫抑制，從而對(duì)其他細(xì)菌及病毒性疾病繼發(fā)感染的敏感性增加［２］。給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)從河南省濮陽(yáng)地區(qū)某雞場(chǎng)疑似傳染性法氏囊病的雞群中采集病料進(jìn)行分離，通過血清學(xué)等方法對(duì)該毒株進(jìn)行了鑒定。現(xiàn)將鑒定過程報(bào)告如下。

１材料與方法

１．１材料

病料采自河南省濮陽(yáng)地區(qū)某小型養(yǎng)雞場(chǎng)的疑似傳染性法氏囊病病雞的法氏囊、脾臟組織；ＳＰＦ雞胚及ＳＰＦ雞購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；ＩＢＤＶ陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；ＲＮＡ提取試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司。

１．２方法

１．２．１病料的處理將采集的病料剪碎、充分研磨后按１∶３的比例加入滅菌的ＰＢＳ液，制成勻漿后反復(fù)凍融３次，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，將處理后的懸液用無菌ＥＰ管分裝，于－８０℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２．２病毒的分離與傳代將１．２．１處理的原始病料懸液滴鼻、點(diǎn)眼接種５只４周齡ＳＰＦ雞，撲殺在接種后３～４ ｄ出現(xiàn)臨床癥狀的病雞，采集法氏囊混合，按１．２．１的方法處理制成懸液。懸液按１∶１０４倍稀釋，０．２ｍＬ／胚接種１０日齡ＳＰＦ雞胚絨毛尿囊膜，３７℃孵育，棄去２４ｈ內(nèi)死亡雞胚，其余２４ｈ后死亡的雞胚無菌收取尿囊膜、尿囊液，混合，研磨后８ ０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，連續(xù)５次傳代。

１．２．３瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 按常規(guī)方法測(cè)定發(fā)病雞只中的ＩＢＤＶ抗原，梅花形孔中央加入ＩＢＤＶ標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，外周孔加入已處理過的法氏囊組織，另外加入ＩＢＤＶ標(biāo)準(zhǔn)抗原做對(duì)照。

１．２．４病毒ＲＮＡ的提取處理過的病料使用Ｔｒｉｚｏｌ離心柱型高純總ＲＮＡ快速提取試劑盒按其產(chǎn)品說明的方法提取。

１．２．５引物的設(shè)計(jì)與合成參照ＧｅｎＢａｎｋ有關(guān)ＩＢＤＶ病毒ＶＰ４片段序列及Ｐｒｉｍｅｒ５．０軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物Ｐ１和Ｐ２，進(jìn)行ＲＴ－ＰＣＲ反應(yīng)［３］。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下：Ｐ１：５′－ＧＣＡＴＡＣＴＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡＧＧＧＣＧＧＧＧ－３′；Ｐ２：５′－ＣＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＡＴＧＧ－３′。

２結(jié)果與分析

２．１病毒的分離與傳代

接種的雞胚于４８～９６ｈ內(nèi)死亡，收集的雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液研磨處理后在雞胚上連續(xù)５次傳代。該病毒在雞胚上死亡時(shí)間穩(wěn)定在６０ｈ左右，且雞胚絨毛尿囊膜（ＣＡＭ）明顯增厚，胚體出血（圖１，圖２）。

２．２瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

待檢抗原、標(biāo)準(zhǔn)抗原與陽(yáng)性血清之間出現(xiàn)的沉淀線完全融合，顯示為陽(yáng)性（圖３）。

２．３ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果

ＰＣＲ產(chǎn)物通過１％的瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)顯示，片段大小為１ ２００ｂｐ左右，與預(yù)期相符合（圖４）。

３小結(jié)與討論

從河南省濮陽(yáng)地區(qū)某疑似傳染性法氏囊病的雞群中采集病料，通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、分子生物學(xué)試驗(yàn)等檢測(cè)方法，證實(shí)分離的病毒為雞傳染性法氏囊病病毒，將其命名為ＰＹ０５株。該病毒在雞胚傳代過程中，可引起雞胚規(guī)律性的死亡，產(chǎn)生明顯的病變。通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，顯示為陽(yáng)性，出現(xiàn)明顯的沉淀線。ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果顯示，得到與預(yù)期相符合的１ ２００ｂｐ左右的片斷［4］。

ＩＢＤＶ主要侵害雞的中樞免疫器官—法氏囊，能引起雞的免疫抑制，從而對(duì)其他細(xì)菌性及病毒性疾病的易感性增強(qiáng)，給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［５］。目前雞傳染性法氏囊病仍是養(yǎng)禽業(yè)防制的主要對(duì)象，對(duì)于該病的預(yù)防，傳統(tǒng)的預(yù)防措施主要是使用弱毒疫苗和滅活疫苗來控制疾病的感染［6］，盡管源于經(jīng)典毒株的各種法氏囊病疫苗在防制傳染性法氏囊病的過程中起到重要的作用，但由于變異毒株和超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，現(xiàn)有的疫苗不能提供有效保護(hù)，常導(dǎo)致免疫失敗和帶來經(jīng)濟(jì)損失［7］。因此，尋找合適的方法研制新型疫苗，也成為獸醫(yī)工作者面臨的重要課題。另外，養(yǎng)雞戶在對(duì)雞群進(jìn)行ＩＢＤ免疫同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、保持環(huán)境衛(wèi)生、減少其他疾病的發(fā)生和影響，這樣才能更好更有效的預(yù)防ＩＢＤ的發(fā)生［8］。

參考文獻(xiàn)：

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