玉竹對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

王業(yè)秋,陳巧云,張寧,井麗巍,祁永華

[摘要]目的：探討玉竹水提液對(duì)中波紫外線（UVB）誘導(dǎo)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法：用64mJ·cm-2的UVB照射人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞建立光老化細(xì)胞模型，以不同濃度玉竹提取物處理光老化細(xì)胞，羥胺法檢測(cè)細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）活性，比色法檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性，TBA法檢測(cè)丙二醛（MDA）含量，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）分泌量。結(jié)果：UVB照射角質(zhì)形成細(xì)胞后，SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，TNF-α、IL-6分泌量增加（P<0.01），玉竹水提液中（100μg·ml-1）、高（200μg·ml-1）劑量組能顯著提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，減少TNF-α、IL-6分泌（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：玉竹水提液可在一定程度上減輕UVB對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的損傷，其機(jī)制可能與其抑制氧化損傷，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，減少炎癥細(xì)胞因子分泌有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]玉竹；UVB；HaCaT細(xì)胞；保護(hù)作用

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）04-0599-03

Protective effects of yuzhu on hacat cells damaged by ultraviolet B

WANG Ye-qiu,CHEN Qiao-yun,ZHANG Ning,JING Li-wei,QI Yong-hua

(Institute of Traditional Chinese Medicine &Cosmetology,Faculty of Jiamusi,Heilongjiang University of Chinese Medicine, Jiamusi 154007,Helongjiang,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect of water-extract solution of Yuzhu on HaCaT cells injured by irradiation of ultraviolet B and its possible mechanisms.MethodsCell photoaging model was established by irradiating HaCaT cells with UVB(64mJ·cm-2). HaCaT cells were treated with different concentration water-extract solution of Yuzhu. The activity of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase(GSH-Px),the content of malondialdehyde(MDA) were detected by biochemical assay, the secretion levels of TNF-α and IL-6 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsThe proliferation activity of HaCaT cells descended with the UVB irradiation, the activities of SOD and GSH-Px decreased, when the content of MDA, TNF-α, IL-6, were ascensive(P<0.01). But under the intervention at middle concentration(100μg·ml-1) and high concentration(200μg·ml-1) of water-extract solution of Yuzhu, the above changes induced by UVB irradiation were inhibited(P<0.05 or P<0.01).ConclusionThe water-extract solution of Yuzhu might inhibit the proliferation decreasing which induced by UVB. And its mechanism may have relationship with the ability of strengthening antioxidation, decreasing oxygen radicals and decreasing the secretions of proinflammatory cytokines.

Key words:Yuzhu;UVB;HaCaT cells;protective effects

隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，到達(dá)地球表面的UV日益增多，UV輻射對(duì)健康的危害已成為全球關(guān)注的重大環(huán)境與健康問(wèn)題之一，有關(guān)UV輻射的機(jī)制和防治研究是目前的研究熱點(diǎn)。中藥以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在抗皮膚光損傷領(lǐng)域的研究工作得到廣泛開(kāi)展，玉竹為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum(Mill.)Druce的干燥根莖，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明玉竹具有抗氧化、清除自由基、提高免疫力、抗腫瘤等多種生物活性[1-3]。筆者以體外培養(yǎng)的人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）為研究對(duì)象，在體外成功建立UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞光損傷模型，觀察玉竹水提液對(duì)UVB損傷HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用。

1材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT（武漢大學(xué)細(xì)胞中心），MEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗（Billab公司），MTT（Sigma公司），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程公司），TNF-α、IL-6（研域(上海)化學(xué)試劑有限公司），中藥玉竹（北京同仁堂制藥集團(tuán)哈爾濱分店，經(jīng)本校陳效忠副教授鑒定為正品）。

1.2 儀器：紫外照射儀（Sigma公司），紫外線輻照計(jì)（北京師范大學(xué)光電儀器廠），Resecarch UV UF型超純水制備系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司），LDZX-4DSBI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），IX-71-21PH型Olympus倒置顯微鏡（日本 Olympus株式會(huì)社），HF90型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器有限公司），MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)熱電公司），MS-500A半自動(dòng)生化分析儀(美生科技有限公司)，MODUL YOD-230冷凍干燥儀（美國(guó)熱電公司）。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物的配置：取玉竹100g加1000ml蒸餾水加熱煮沸1h，減壓抽濾后，濾渣加1000ml水提取兩次，合并三次濾液，濃縮成浸膏，經(jīng)冷凍干燥制成粉末，保存于4℃冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)取玉竹凍干粉用MEM培養(yǎng)液配成所需濃度，調(diào)pH值為7.0，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。

2.2 HaCaT的培養(yǎng)：HaCaT細(xì)胞在含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以0.25%胰酶和0.02%EDTA消化，調(diào)整其密度為5×105個(gè)·ml-1，定量接種于12孔板。

2.3 細(xì)胞光老化模型的建立：參照文獻(xiàn)[4-5]的方法，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞單層貼壁后，棄培養(yǎng)液，每孔加入1ml PBS，使用64mJ·cm-2的UVB照射，空白組用鋁箔蓋住。

2.4 實(shí)驗(yàn)分組：預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)置50μg·ml-1、100μg·ml-1、150μg·ml-1、200μg·ml-1、250μg·ml-1、300μg·ml-1 6個(gè)劑量組做玉竹對(duì)正常HaCaT細(xì)胞的毒性作用實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)250μg·ml-1、300μg·ml-1對(duì)HaCaT細(xì)胞有明顯毒性作用，因此正式實(shí)驗(yàn)確定的玉竹最高劑量組為200μg·ml-1。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于12孔板，隨機(jī)分為空白組、模型組、玉竹水提液低（50μg·ml-1）、中（100μg·ml-1）、高（200μg·ml-1）劑量組。接種24h后各組棄培養(yǎng)液，每孔加入1ml PBS，除空白對(duì)照組外，按照2.3的方式造模。照射后棄去PBS，加入含藥的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以上各組細(xì)胞每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

2.5 檢測(cè)細(xì)胞中SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量：給藥24h后收集各組細(xì)胞，用冷PBS清洗2次，超聲破碎細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)SOD活性，GSH-Px活性和MDA含量。

2.6 ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6：給藥24h后收集各組細(xì)胞的上清液，按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)腫瘤壞死因子TNF-α和白介素IL-6的分泌量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS13.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多樣本間的方差分析采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1 玉竹水提液對(duì)HaCaT細(xì)胞SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量的影響：見(jiàn)表1。由表1得，與空白對(duì)照相比，模型對(duì)照組的SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型對(duì)照組相比較，玉竹水提液各劑量組均能提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量；且玉竹水提液中、高劑量組與模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。

3.2 玉竹水提液對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6的影響：見(jiàn)表2。由表2得，與模型對(duì)照組相比較，玉竹水提液各劑量組均能降低TNF-α與IL-6分泌量；且玉竹水提液中、高劑量組與模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。

4討論

4.1 紫外線輻射是皮膚物理性損傷的主要因素，長(zhǎng)期的紫外線輻射最終可導(dǎo)致光老化和皮膚腫瘤。波長(zhǎng)短能量較高的UVB（290～320nm）主要作用于表皮，角質(zhì)形成細(xì)胞是其靶細(xì)胞，UVB可以使角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，誘發(fā)氧化反應(yīng)，引起一系列的氧化性損傷[6]，導(dǎo)致超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶含量下降，非酶自由基清除劑耗竭，過(guò)氧化最終產(chǎn)物丙二醛（MDA）等大量積累，而損傷的皮膚抗氧化防御體系會(huì)導(dǎo)致更多ROS的產(chǎn)生，以正反饋形式加劇皮膚組織和細(xì)胞的損傷。另外角質(zhì)形成細(xì)胞在UVB輻射后可釋放多種介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等生物學(xué)作用的細(xì)胞因子[7-9]。其中TNF-α是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中心之一，可導(dǎo)致多種細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡，IL-6是角質(zhì)形成細(xì)胞-成纖維細(xì)胞相互作用環(huán)路中的重要中介物質(zhì)，其主要免疫學(xué)功能是加強(qiáng)其它細(xì)胞因子的效果。

中草藥對(duì)皮膚的光保護(hù)作用日益受到臨床的重視和應(yīng)用[10]。傳統(tǒng)中藥玉竹用于抗衰老的歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就將其奉為上品，謂“久服，去面黑，好顏色潤(rùn)澤，輕身不老”?，F(xiàn)代藥理研究表明玉竹能抗氧化，清除自由基、抗炎等多種生物活性及藥理作用，說(shuō)明玉竹具有抗皮膚光損傷的潛力，筆者的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)玉竹對(duì)人皮膚真皮層的成纖維細(xì)胞具有很好的光保護(hù)作用[11]，本文從人表皮層角質(zhì)形成細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)和細(xì)胞因子分泌來(lái)探討玉竹抗皮膚損傷的作用機(jī)理。

4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，玉竹水提液低劑量組（50μg·ml-1）保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受UVB損傷的作用效果不明顯；中（100μg·ml-1）、高劑量組（200μg·ml-1）均能顯著提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，有效地對(duì)抗UVB對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞氧化性損傷。同時(shí)玉竹水提液中高劑量組可以抑制UVB引起的TNF-α和IL-6的分泌來(lái)減輕紫外線引起的皮膚光老化及炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

綜上，玉竹可以通過(guò)多種途徑抑制紫外線對(duì)皮膚的損傷。本研究對(duì)防護(hù)紫外線產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有參考價(jià)值，可以為尋求天然防曬劑提供理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]單 穎,姜 東,潘興瑜,等.玉竹多糖對(duì)衰老模型鼠細(xì)胞及體液免疫功能的影響[J].中國(guó)臨床康復(fù),2006,10(19):146-148.

[2]李盛青,徐大量,林 輝.玉竹抗衰老有效部位的藥效篩選[J].中藥新藥與臨床藥理,2008,19(3):177-180.

[3]徐大量,林 輝,李盛青,等.玉竹水提液體內(nèi)外抗氧化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥材,2008,31(5): 729-731.

[4]陳巧云,王業(yè)秋,張 寧,等.玉屏風(fēng)散抗角質(zhì)形成細(xì)胞光損傷作用的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2011,22(4):847-849.

[5]李建民,徐艷明,陳巧云,等. 杜仲對(duì)UVA致HaCaT細(xì)胞光老化保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2010,19(9):1316-1318.

[6]Halliday GM. Inflammation, gene mutation and photoimmunosuppression inresponse to UVR-induced oxidative damage contributes to photocarcinogenesis[J]. Mutat Res, 2005, 571(1/2):107-120.

[7]Marionnet AV,Chardonnet Y,Viac J,et al. Differences in responses of interleukin-8 and tumor necrosis factor alpha production and secretion to cyclosporin-A and ultraviolet B irradiation by normal and transformed keratinocyte cultures[J].Exp Dermatol,1997,6(1): 22-28.

[8]Di Girolamo N,Wakefield D,Coroneo MT.UVB mediated induction of cytokines and growth factors in pterygium epithelial cells involves cell surface receptors and intracellular signaling [J].Inv Ophth Vis Sci,2006,47(6):2430-2437.

[9]Mary FB, Michael KR, Elma DB,et al.Skin Immune Systems and Inflammation: Protector of the Skin or Promoter of Aging[J]? J Invest Dermatol,2008,13(1):15-19.

[10]戚秀中,張?zhí)镆?蘇永華,等.具有抗紫外線皮膚損傷作用的常用中藥[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2010, 19(1):1728-1729.

[11]王業(yè)秋,陳巧云,魯光寶,等.玉竹水提液對(duì)UVA誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2011,22(5):1263-1264.

[收稿日期]2011-11-22[修回日期]2012-02-10

編輯/張惠娟