靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細胞參與皮膚擴張的可行性研究

王曉燕 鄭巖 孟寶璽 夏煒 馬顯杰 王志軍

[摘要]目的：探討經(jīng)耳源靜脈移植入體內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells ，BM-MSCs）參與皮膚擴張的情況。方法：以小型家豬為研究對象，分離培養(yǎng)并鑒定豬BM-MSCs。制作豬皮膚擴張模型，8頭豬隨機分為兩組，每組4頭，實驗組（A組）：擴張后耳源靜脈注入DiI標記的豬BM-MSCs；對照組（B組）：擴張后耳源靜脈注入等量PBS，分別于擴張后7、14、28天測量兩組擴張面積，冰凍切片觀察標記細胞在擴張皮膚中的比例和分布情況，Real-time PCR檢測基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）表達情況。結(jié)果：流式細胞儀鑒定細胞CD29、CD90表達陽性，CD34、CD45表達陰性，細胞標記率＞99%。擴張后第14天、28天實驗組擴張面積較對照組明顯增加（P＜0.05），冰凍切片顯示，14天時實驗組擴張皮膚可見DiI標記細胞聚集。PCR示SDF-1表達量實驗組是對照組的5.8倍。結(jié)論：經(jīng)靜脈移植的BM-MSCs可遷移至擴張局部，并能有效促進皮膚擴張。

[關鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細胞；靜脈移植；皮膚擴張

[中圖分類號]R622Q813.1[文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）04-0596-03

Study on the feasibility of BM-MSCs transplanted through systemic vein to improve the skin expansion

WANG Xiao-yan1,ZHENG Yan1,MENG Bao-xi2,XIA Wei1,MA Xian-jie1,WANG Zhi-jun3

（1Institutes of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an710032, Shaanxi, China；2.Department of Plastic Surgery,The Fifst People's Hospital, Zhengzhou；3.Department of Plastic Surgery, Affiliated Xinhua Hospital of Dalian Medical College）

Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of transplantation of mesenchymal stem cell from ear vein into the skin and soft tissue expansion model.Methods MSCs were isolated from porket's bone marrow and cultured in vitro. Eight pigs were randomly divided into two groups: The group A was injected with MSCs which dyed with CM-DiI from ear vein; the group B was injected with PBS from ear vein as the control group. The expansion area was measured on day7,14,28 after operation and the proportion and distribution of labeled cells were detected by frozen section . Real-time quantitative PCR was used to quantify the expression of chemotactic growth factor-1(SDF-1).Results The MSCs cultured expressed CD90 and CD29 highly but didn't express CD34 or CD45. The mark rate>99%. On day 14 and 28, the area of experimental group was increased significantly,compared to the control group (P＜0.05). The result of frozen section show that the DiI-labled cells were gathered together in the experimental group on day 14 after expansion. Real-time quantitative PCR show that the target gene expression of SDF-1 was 5.8-fold higher than the control group. Conclusion BM-MSCs transplantated from ear vein can migrate to the local of expansion and promote the skin expansion.

Key words:bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs); vein transplantation; skin expansion

皮膚擴張術由于其良好的修復效果，成為整形外科最常用的修復手段之一。但皮膚擴張術存在治療周期長、術后皮瓣回縮的缺點，如何在短時間擴張出更多新生的皮膚成為有待解決的問題。骨髓間充質(zhì)干細胞由于其多項分化功能、活性強、易分離培養(yǎng)等優(yōu)點成為創(chuàng)傷修復領域的熱點[1-2]，而皮膚擴張術本質(zhì)上也是創(chuàng)傷修復的過程，因此本實驗經(jīng)靜脈移植染色標記后的骨髓間充干細胞于擴張器模型，觀察其在擴張皮膚內(nèi)的分布和比例，擬為間充質(zhì)干細胞移植促進擴張皮膚新生探尋一種無創(chuàng)性的移植方案。

1材料和方法

1.1 材料：Ficoll-1.077細胞分離液（天津灝洋生物技術公司，中國）、DMEM培養(yǎng)基（Hyclone，USA），胎牛血清（Hyclone，USA），F(xiàn)ITC標記的鼠抗豬CD29和CD90（Becton Dickinson公司，美國）、CD34（Thermo scientific，美國）、CD45(Santa Cruz公司，美國)， CM-DiI(碳花青熒光染料，Molecular Probes公司，美國)，引物合成（上海捷瑞生物工程有限公司），總RNA提取試劑盒，熒光定量PCR試劑盒（AB公司，美國）、流式細胞儀（Becton Dickinson公司，美國），80ml矩形單向擴張器（上海威寧公司，中國）48個，乳豬（5天齡，3kg）1頭，小型家豬（3月齡，15±5kg）8頭由第四軍醫(yī)大學動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 BM-MSCs的分離、培養(yǎng)：無菌條件下解剖乳豬雙側(cè)股骨，用PBS沖出骨髓，1.077g/ml Ficoll分離液分離（1500rpm，30min），取界面單核細胞層離心洗滌后接種于含完全培養(yǎng)基（DMEM +10%胎牛血清）的培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，48h換液，待貼壁細胞培養(yǎng)達80%～90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2流式鑒定BM-MSCs及細胞標記：取培養(yǎng)至第三代的BM-MSCs，0.25%胰酶消化，400μl的PBS重懸，調(diào)整細胞濃度為5×105/ml，分別加入FITC標記的鼠抗豬CD90、CD34、CD45、CD29抗體，4℃避光孵育30min，PBS重懸后上流式細胞儀檢測。傳代后的BM-MSCs加入2μg/ml的CM-DiI溶液孵育，PBS洗滌后制成含細胞數(shù)量約25×106/ml的單細胞懸液。

1.2.3實驗分組：A組：植入擴張器后，耳緣靜脈注射DiI標記的MSCs細胞懸液6ml，含細胞約1.5×108；B組：植入擴張器后，耳源靜脈緩慢注射PBS 6ml。

1.2.4 擴張模型：小型豬用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，在脊柱兩側(cè)各設計3個皮瓣，皮瓣中心上文出4cm×4cm大小面積。距脊柱2cm作縱行切口，深達深筋膜，按擴張器基底部大小在深筋膜淺層分離出4cm×6cm的皮下腔隙，置入80ml矩形單向擴張器，分層縫合皮膚。各組每隔三天注水一次，每次注水10ml。

1.2.5 擴張面積的測定：擴張后第7、14、28天分別測量兩組標記面積，共48個擴張皮瓣，每組每個時間點擴張皮瓣為8個。應用統(tǒng)計學方法，比較兩組皮膚的擴張面積。

1.2.6 冰凍切片觀察DiI細胞的比例和分布：分別取兩組擴張后第7，14，28天的新鮮皮膚標本，連續(xù)冰凍切片，熒光顯微鏡下（200×）避光觀察DiI細胞在擴張皮膚中的比例和定位。

1.2.7 SDF-1在擴張局部表達量的觀察：取各組擴張第14天的皮膚組織，提取總RNA后常規(guī)反轉(zhuǎn)錄，半定量PCR檢測引物的特異性，熒光定量PCR分析目的基因趨化生長因子SDF-1相對表達量。以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.8 統(tǒng)計方法：數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，用SPSS16.0版統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，而兩兩之間的比較采用獨立樣本參數(shù)t檢驗，P＜0.05為差異有顯著的統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 BM-MSCs的培養(yǎng)、鑒定結(jié)果：體外培養(yǎng)的BM-MSCs呈多角形或梭形，12天左右細胞達到單層匯合的80%～90%。流式細胞檢測結(jié)果表明BM-MSCs不表達CD34和CD45，但表達CD29和CD90。

2.2 BM-MSCs標記結(jié)果：CM-DiI染色標記傳代后的細胞，用計數(shù)板計數(shù)，比較同視野白光及熒光下細胞數(shù)目，可見細胞均勻分布，熒光明亮，細胞標記率＞99%。

2.3 面積測定：隨著擴張時間延長，兩組擴張皮瓣的標記面積增加，且實驗組增加較多，擴張第28天，A、B兩組擴張面積分別為（32.54±0.88）cm2、（30.11±0.58）cm2（P＜0.05）。

2.4 擴張皮膚冰凍切片結(jié)果：分別取兩組擴張第7、14、28天皮膚，連續(xù)冰凍切片觀察，結(jié)果顯示A組擴張皮膚第7天僅見少量CM-DiI標記細胞分布，14天時可見CM-DiI標記細胞聚集，隨著擴張時間延長，標記細胞增多，主要分布在真皮層。B組皮膚內(nèi)未見標記細胞（圖1）。

2.5SDF-1在擴張局部的表達量結(jié)果：半定量PCR檢測結(jié)果：目的基因條帶亮度A組高于B組（圖2）。實時定量PCR檢測結(jié)果：A組SDF-1的表達量為B組的5.8倍（P＜0.05）。以GAPDH為內(nèi)參（圖3）。

3討論

3.1 近年來，骨髓間充質(zhì)干細胞由于其多項分化能力、低免疫源性、易獲得培養(yǎng)等優(yōu)點成為再生醫(yī)學研究的熱點[1-2]。在皮膚創(chuàng)傷修復方面，大量研究證實移植的BM-MSCs參與皮膚的損傷修復過程[3-6]，BM-MSCs有很好的可塑性，能夠動員到受損組織局部，成為結(jié)構組成細胞[7-8]，國內(nèi)外大量研究證實移植到創(chuàng)面上的異體BM-MSCs能夠通過分化為皮膚細胞和分泌生長因子促進創(chuàng)面愈合[9]。Yaojiong wu和liwen chen等的研究也證實了靜脈給予的異體BM-MSCs通過分化和旁分泌作用促進了傷口愈合和皮膚新生[10]。有研究表明間充質(zhì)干細胞會向缺氧環(huán)境遷移[11]，擴張皮膚在擴張期處于缺氧狀態(tài)，因而極有可能趨化BM-MSCs到擴張區(qū)域。本實驗通過將CM-DiI熒光標記的BM-MSCs靜脈移植入皮膚擴張模型，旨在探討異體移植的BM-MSCs能否遷移至擴張區(qū)域并促進擴張局部皮膚的新生。

3.2 CM-DiI是一種親脂性熒光染料，易嵌入生物質(zhì)膜內(nèi)而標記整個細胞膜[12]。CM-DiI標記對細胞的活性、發(fā)育或其它基本的生理特性無明顯影響[13]，不容易在標記與非標記細胞之間傳遞，且熒光保持時間長，可作為體外培養(yǎng)細胞所特有的標記物以區(qū)分在體細胞。本實驗采用CM-DiI標記豬 BM-MSCs后，結(jié)果顯示標記效率達99%，細胞在熒光顯微鏡下發(fā)出明亮的紅色熒光，于標記后 28天仍然保持較清楚的熒光，也證實了移植的BM-MSCs向擴張區(qū)域的遷移。

3.3 眾多體內(nèi)外實驗表明細胞因子可以影響干細胞移植的微環(huán)境[14]，進而影響骨髓間充質(zhì)干細胞的動員、遷移及分化?；|(zhì)細胞衍生因子-1屬于趨化因子之一，具有廣泛的生物學活性。研究證實SDF-1能夠充當骨髓干細胞定向遷移的化學引誘物[15]，同時它也可以增強骨髓干細胞的運動能力[16]，Lee等[17]體外實驗也發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)細胞衍生因子-1誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向其趨向遷移。本實驗結(jié)果顯示移植細胞組SDF-1分泌量較對照組增高，從而誘導移植的BM-MSCs向擴張區(qū)域遷移，在局部起到促進擴張皮膚新生的作用。

3.4 靜脈移植由于可以反復、多次、大量進行無創(chuàng)的治療，是最具有應用前景的治療方法。但也有研究表明，移植BM-MSCs后早期大量細胞集聚于肺臟[18]，待損傷局部炎癥減退后，BM-MSCs可逐漸遷移至局部。Gao[19]的實驗也表明移植之前首先給予靜脈注射硝普鈉等血管擴張藥物會明顯減少細胞在肺組織內(nèi)的存留。因此如何減少移植細胞在肺組織內(nèi)的存留，以及靜脈移植細胞后擴張局部聯(lián)合應用SDF-1是否能更好的促進擴張皮膚新生有待進一步的研究。

[參考文獻]

[1]Jiang Y,Jahagirdar BN,Reinhardt RL,et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow [J].Nature, 2002, 418:41-49.

[2]Silva GV, Litovsky S, Assad JA, et al. Mesenchymal stem cells differentiate into an endothelial phenotype, enhance vascular density, and improve heart function in a canine chronic ischemia model[J].Circulation,2005,111(2):150-156.

[3]Herzog EL,Chai L,Krause DS. Plasticity of marrow-derived stem cells [J].Blood, 2003, 102:3483-3493.

[4]Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues [J].Science, 1997, 276:71-74.

[5]Wu Y,Wang J,Scott PG,et al. Bone marrow-derived stem cells in wound healing: a review[J]. Wound Repair Regen, 2007, 15 Suppl 1:S18-26.

[6]Fox JM,Chamberlain G,Ashton BA,et al. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking [J].Br J Haematol,2007,137(6):491-502.

[7]Bauer SM, Bauer RJ, Liu ZJ,et al.Vascular endothelial growth factor-C promotes vasculogenesis, angiogenesis, and collagen constriction in three-dimensional collagen gels[J].J Vasc Surg,2005, 41(4):699-707.

[8]Fathke C, Wilson L, Hutter J, et al. Contribution of bone marrow-derived cells to skin: collagen deposition and wound repair [J]. Stem Cells. 2004. 22: 812-822.

[9]Branski LK,Gauglitz GG,Herndon DN,et al.A review of gene and stem cell therapy in cutaneous wound healing[J].Burns,2009,35(2):171-180.

[10]Chen L,Tredget EE,Wu PY,et al.Paracrine factors of mesenchymal stem cells recruit macrophages and endothelial lineage cells and enhance wound healing[J].PLoS ONE.2008, 3(4):e1886.

[11]何覓春,李靜,趙春華.低氧對間充質(zhì)干細胞的影響[J].中國實驗血液學雜志,2007,15( 2): 433-436.

[12]Aoto K,Shikata Y,Imai H,et al. Mouse Shh is required for prechordal plate maintenance during brain and craniofacial morphogenesis [J].Dev Biol, 2009, 327(1):106-120.

[13]Hemmrich K,Meersch M,vonHeimburg D,et al. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissueen gineering [J].Cells Tissues Organs,2006,184(3-4):117-127．

[14]Stewart AA, Byroun CR, Rondenis H,et al.Effect of fibroblast growth factor-2 on equine mesenchymal stem cell monolayer expansion and chondrogenesis[J].Am J Vet Res,2007,68:941-945.

[15]Peled A, Petit I, Kollet D,et al.Dependence of human stem cell engraftment and repoupulation of NOD/SCID mice on CXCR4[J].Science,1999,283:845-848.

[16]Reca R,Mastellos D,Majka M,et al. Functional receptor for C3a anaphylatoxin is expressed by normal hematopoietic stem/progenitor cells,and C3a enhances their homing-related responses to SDF-1[J].Blood,2003,101:3784-3793.

[17]Lee RH,Hsu SC,Munoz J,et al.A subset of human rapidly self-renewing marrow stromal cells preferentially engraft in mice[J].Blood,2006,107(5):2153-2161.

[18]Kraitchman DL,Tat sumi M,Gilson WD,et al.Dynamic imaging of allogeneic mesenchymal stem cells trafficking to myocardial infarction[J].Circulation,2005,112:1451-1461.

[19]Kucia M,Dawn B,Hun G,et al.Cells expressing early cardiac markers reside in the bone marrow and are mobilized into the peripheral blood af ter myocardial infarction[J].Circ Res,2004,95:1191-1199.

[收稿日期]2011-09-13 [修回日期]2011-01-28

編輯/張惠娟