阿司匹林對(duì)正常人表皮黑素細(xì)胞系PIG1細(xì)胞黑素生成的影響

湯玲珍,堅(jiān)哲,劉邦民,李凱,李強(qiáng),李春英,高天文

[摘要]目的：觀察阿司匹林對(duì)體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞系PIG1細(xì)胞的活力、黑素生成及酪氨酸酶活性的影響。方法：用不同濃度的阿司匹林處理PIG1細(xì)胞72h，CCK-8比色法測(cè)定阿司匹林對(duì)PIG1細(xì)胞活力的影響；光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；氫氧化鈉裂解法測(cè)定黑素的含量；體外多巴氧化反應(yīng)法測(cè)定酪氨酸酶活性的變化。結(jié)果：阿司匹林濃度小于或者等于500μmol/L時(shí)無(wú)明顯細(xì)胞毒性；濃度大于或者等于125μmol/L時(shí)以劑量依賴方式抑制黑素生成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性無(wú)顯著性變化（P>0.05）。結(jié)論：阿司匹林抑制PIG1細(xì)胞的黑素生成，可能應(yīng)用于色素增多性皮膚病。

[關(guān)鍵詞]阿司匹林；黑素細(xì)胞；黑素生成；酪氨酸酶

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）04-0593-03

Effects of aspirin on melanogenesis of human epidermal melanocyte cell line PIG1 cells in vitro

TANG Ling-zhen,JIAN Zhe,LIU Bang-min,LI Kai,LI Qiang,LI Chun-ying,GAO Tian-wen

(Institute of Dermatology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032, Shaanxi,China)

Abstrat:ObjectiveTo investigate the effects of aspirin on cell viability, tyrosinase activity and melanogenesis of human epidermal melanocyte cell line PIG1 cells in vitro.MethodsAfter treating PIG1 cell with aspirin in different concentrations for 72h, we employed CCK-8 assay, oxidative DOPA reaction and NaOH method to measure the cell viability, tyrosinase activity and melanogenesis of PIG1 cells respectively. The morphologic changes of PIG1 cells were observed via light microscope.ResultsAspirin had no significant effect on the cell viability of PIG1 cells when the concentrations were lower than 500μmol/L. The melanogenesis of PIG1 cells was remarkably decreased in a concentration-dependent manner by aspirin at the concentrations higher than 125μmol/L (P<0.05). However the tyrosinase activity had no significant change after aspirin treatment (P>0.05).ConclusionAspirin can inhibit the melanogenesis of PIG1 cells, thus it may be developed as a clinical treatment of hyperpigmented skin diseases.

Key words: aspirin; melanocyte; melanogenesis; tyrosinase

人皮膚顏色的深淺主要由表皮中黑素細(xì)胞生成的黑素量決定，抑制黑素生成一直是皮膚美白及治療色素增多性疾病的主要策略。酪氨酸經(jīng)過(guò)一系列氧化反應(yīng)生成黑素的過(guò)程中，需要活性氧的參與[1]，因此，抗氧化劑通常能減少活性氧來(lái)抑制黑素的生成[2]。阿司匹林是臨床常用的非甾體類抗炎藥（NSAIDs），具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用。近年來(lái)有研究證實(shí)阿司匹林具有清除自由基及抗氧化作用[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林能降低小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的酪氨酸酶表達(dá)[5]，但阿司匹林對(duì)正常人黑素細(xì)胞黑素生成及酪氨酸酶活性的影響還未有研究報(bào)道。本研究探討了阿司匹林對(duì)體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞系PIG1細(xì)胞的黑素生成及酪氨酸酶活性的影響，為其應(yīng)用于色素增多性皮膚病的預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1永生化正常人表皮黑素細(xì)胞系PIG1細(xì)胞：本實(shí)驗(yàn)室保存。由美國(guó)Loyola 大學(xué)Caroline Le Poole博士贈(zèng)送。為正常新生兒包皮組織運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染16型人乳頭瘤病毒E6和E7開(kāi)放讀碼框得來(lái)，與正常黑素細(xì)胞生物學(xué)特性相似[6]。

1.1.2主要試劑和儀器：254培養(yǎng)基及人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑（美國(guó)Cascade Biologics/Invitrogen公司），胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司），阿司匹林（美國(guó)Sigma公司），CCK-8（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索萊寶科技有限公司），NaOH（天津石博迪化工有限公司），左旋多巴（L-DOPA）（美國(guó)Amresco公司），TritonX-100（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），酶聯(lián)免疫分析儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2方法

1.2.1試劑配制：使用前，人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑以1:100體積比加入到254培養(yǎng)基中。阿司匹林先用無(wú)水乙醇溶解配制成0.5M溶液，再用無(wú)血清254培養(yǎng)基配制成10mM濃度的阿司匹林原溶液，保存于4℃冰箱內(nèi)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)：PIG1細(xì)胞置于含5%胎牛血清，100U/ml青霉素及100mg/ml鏈霉素的254培養(yǎng)基中，37℃含5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3 阿司匹林對(duì)PIG1細(xì)胞活力影響的測(cè)定：采用CCK-8法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)消化離心后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×105/ml，以100μl/孔接種于96孔板，37℃ CO2孵箱培養(yǎng)24h，細(xì)胞完全貼壁后吸去原培養(yǎng)基，分別加入100μl無(wú)血清254培養(yǎng)基配制的終濃度為62.5μM、125μM、250μM、500μM、1000μM、2000μM的阿司匹林溶液，對(duì)照組只加無(wú)血清254培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立空白組（單純培養(yǎng)基）。37℃ CO2孵箱培養(yǎng)72h后，先用倒置顯微鏡觀察PIG1形態(tài)學(xué)變化，接著分別向空白組、對(duì)照組、阿司匹林處理組每孔加入10μl CCK-8溶液，37℃孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育90min，酶聯(lián)免疫分析儀450nm處測(cè)吸光度值（A）。阿司匹林處理組相對(duì)細(xì)胞活力=（A阿司匹林組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

1.2.4阿司匹林對(duì)PIG1細(xì)胞黑素生成影響的測(cè)定[2]：采用NaOH裂解法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)消化離心后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×105/ml，接種及分組同上。阿司匹林處理72h后，吸去上清，用1×PBS洗2次，每孔加入100μl濃度為1M的NaOH溶液，37℃水浴1h，酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)的吸光度值（A）。阿司匹林處理組相對(duì)黑素含量=（A阿司匹林組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

1.2.5阿司匹林對(duì)PIG1細(xì)胞酪氨酸酶活性影響的測(cè)定：采用體外DOPA氧化反應(yīng)法,細(xì)胞接種方法和分組同黑素含量測(cè)定。阿司匹林處理72h后，吸去上清，用1×PBS洗2次，每孔加入90μl濃度為1%的TritonX-100溶液，迅速置于-80℃冰箱內(nèi)凍存30min，室溫下融化使細(xì)胞完全裂解。每孔加入100μl濃度為0.1%的L-DOPA（1×PBS配制）溶液，37℃孵育2h，酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)的吸光度值（A）。阿司匹林處理組相對(duì)酪氨酸酶活性=（A阿司匹林組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)以x±s表示，利用SPSS12.0進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1 阿司匹林對(duì)PIG1細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞活力的影響：阿司匹林濃度在62.5～500μM時(shí)，PIG1細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異。阿司匹林濃度大于1000μM時(shí)，細(xì)胞樹突變短，胞體肥大。細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果為阿司匹林在濃度小于或等于500μM時(shí)，細(xì)胞活力與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。阿司匹林濃度大于或者等于1000μM時(shí)，細(xì)胞活力以劑量依賴方式降低，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1、2）。

2.2 阿司匹林對(duì)PIG1細(xì)胞黑素生成的影響：阿司匹林在62.5～500μM濃度范圍內(nèi)，以濃度依賴方式降低黑素生成量，其中125μM 、250μM、500μM阿司匹林處理組黑素生成量的降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3阿司匹林對(duì)PIG1細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響：阿司匹林在62.5～500μM濃度范圍內(nèi)，酪氨酸酶活性與對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05）（表2）。

3討論

3.1 一直以來(lái)，色素增多性疾病如炎癥性色素沉著、黃褐斑等都是困擾皮膚科醫(yī)師的難題。如何在不殺傷黑素細(xì)胞的情況下降低黑素合成一直是研究者不斷探索的治療方法。近年來(lái)，從植物中提取的具有抗氧化性質(zhì)的活性成分，如姜黃素[2]、茶黃素[7]、槲黃素[8]、萊菔硫烷[9]等，被證實(shí)具有抑制黑素生成的作用。阿司匹林最初來(lái)源于柳樹，同樣發(fā)現(xiàn)其具有清除自由基及抗氧化作用[3-4]，因此我們研究了阿司匹林對(duì)黑素細(xì)胞黑素生成及酪氨酸酶活性的影響。

3.2 本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)正常人表皮黑素細(xì)胞系PIG1細(xì)胞的培養(yǎng)，我們觀察到濃度在62.5～500μM之間的阿司匹林對(duì)黑素細(xì)胞無(wú)明顯毒性，降低了黑素生成量，但是對(duì)酪氨酸酶活性無(wú)顯著影響。之前Sato K等[5]發(fā)現(xiàn)2mM阿司匹林作用5天后，小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的黑素生成量顯著降低，酪氨酸酶蛋白量顯著降低，但是體外酪氨酸酶活性無(wú)顯著變化，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，有些差異可能由于細(xì)胞系不同或體外實(shí)驗(yàn)誤差導(dǎo)致。研究顯示大多數(shù)藥物是通過(guò)抑制酪氨酸酶活性來(lái)抑制黑素生成[2,8- 9]，但是酪氨酸羥基化形成多巴與多巴氧化形成多巴醌最終生成黑素的一系列反應(yīng)過(guò)程中，涉及多種信號(hào)通路，如腺苷酸環(huán)化酶/cAMP-依賴蛋白激酶通路、MAP激酶通路、PI激酶/p70SG激酶通路、PKC依賴通路[10]，除了主要的調(diào)控因素酪氨酸酶，相關(guān)的調(diào)控或影響因素還有Pmel基因家族、內(nèi)皮素、過(guò)氧化物酶、多巴醌及轉(zhuǎn)錄因子MITF[10-11]，因此阿司匹林可能通過(guò)其他途徑抑制黑素生成，如可通過(guò)抑制COX或NF-κB等影響某個(gè)信號(hào)通路，導(dǎo)致黑素生成或轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中某個(gè)步驟改變，或者通過(guò)清除自由基改變黑素生成反應(yīng)中的氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致不同類型黑素顆?；蛘吆谒厍拔镔|(zhì)比例改變，進(jìn)而影響了黑素的生成量。因此，明確阿司匹林對(duì)黑素生成的具體影響機(jī)制，還需要進(jìn)行深入的研究來(lái)證實(shí)。

3.3 阿司匹林臨床應(yīng)用廣泛，具有價(jià)格實(shí)惠、安全性強(qiáng)以及較易推廣的特點(diǎn)。臨床上有經(jīng)驗(yàn)顯示非甾體類抗炎藥治療炎癥后色素沉著有良好療效，也有研究顯示局部應(yīng)用前列腺素E2、F2α及類似物增加毛發(fā)生長(zhǎng)和黑素生成[5]。因此，阿司匹林應(yīng)用于色素增多性疾病的治療具有良好的前景。同時(shí)，阿司匹林對(duì)黑素生成的研究將為其治療色素增多性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為其進(jìn)一步推廣奠定基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Mastore M,Kohler L,Nappi AJ.Production and utilization of hydrogen peroxide associated with melanogenesis and tyosinase-mediated oxidation of DOPA and dopamine[J].FEBS J,2005, 272(10):2407-2415.

[2]林 茂,盧姍姍,齊曉怡,等. 姜黃素對(duì)正常人表皮黑素細(xì)胞黑素生成的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2011,10(1):5-7.

[3]Shi X, Ding M, Dong Z, et al. Antioxidant properties of aspirin: characterization of the ability of aspirin to inhibit silica-induced lipid peroxidation, DNA damage,NF-kappaB activation,and TNF-alpha production[J]. Mol Cell Biochem,1999,199(1-2):93-102.

[4]Podhaisky HP,Abate A,Polte T,et al. Aspirin protects endothelial cells from oxidative stress--possible synergism with vitamin E[J]. FEBS Lett,1997,417(3):349-351.

[5]Sato K,Takahashi H,Iraha R,et al. Down-regulation of tyrosinase expression by acetylsalicylic acid in murine B16 melanoma[J]. Biol Pharm Bull,2008,31(1):33-37.

[6] Le Poole IC,van den Berg FM,van den Wijngaard RM,et al.Generation of a human melanocyte cell line by introduction of HPV16 E6 and E7 genes[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,1997,33(1):42-49.

[7]Yamaka Y,Ohguchi K,Itoh T,et al. Effecs of theaflavins on melanin biosynthesis in mouse B16 melanoma cells[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2009,73(6):1429-1431.

[8]Fujii T, Saito M. Inhibitory effect of quercetin isolated from rose hip (Rosa canina L.) against melanogenesis by mouse melanoma cells[J].Biosci Biotechnol Biochem,2009,73(9):1989-1993.

[9]Shirasugi I, Kamada M, Matsui T, et al. Sulforaphane inhibited melanin synthesis by regulating tyrosinase gene expression in B16 mouse melanoma cells[J].Biosci Biotechnol Biochem,2010,74(3):579-582.

[10]賈 虹,林 麟.黑素細(xì)胞的生物學(xué)和黑素生成的新進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊(cè),2002,28(2):125-127

[11]王正輝,楊壯群.黑素及影響黑素生成的因素[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2002,11(3):278-280.

[收稿日期]2011-12-26 [修回日期]2012-02-16

編輯/張惠娟