不同支架材料體外構(gòu)建組織工程軟骨的研究

葛平 王正輝 楊壯群 王瑞 溫繡藺

[摘要]目的：體外構(gòu)建組織工程軟骨，篩選更為適合組織工程軟骨構(gòu)建的支架材料。方法：體外獲取SD大鼠肋軟骨細胞。采用第一代軟骨細胞作為種子細胞，接種于殼聚糖/明膠和BMG/生物蛋白膠支架，體外培養(yǎng)的不同時間對其進行HE、甲苯胺藍染色、Masson染色、免疫學(xué)檢測、掃描電鏡觀察。結(jié)果：在培養(yǎng)2周時，BMG/生物蛋白膠各種染色結(jié)果顯示軟骨細胞在其表面以及內(nèi)部分布均勻，蛋白多糖和Ⅱ型膠原染色陽性；殼聚糖/明膠表面細胞稍多于前者，但內(nèi)部細胞數(shù)量極少且分布不均，染色結(jié)果不如前者明顯。隨著培養(yǎng)時間的延長各種檢測均顯示有大量的軟骨細胞特異性的蛋白多糖和Ⅱ型膠原的表達，殼聚糖/明膠凸顯出明顯的優(yōu)勢。結(jié)論：體外成功構(gòu)建組織工程軟骨，軟骨細胞在BMG/生物蛋白膠上的生長、增殖和分泌基質(zhì)情況優(yōu)于殼聚糖/明膠支架。

[關(guān)鍵詞]軟骨細胞；組織工程；殼聚糖/明膠；BMG/生物蛋白膠

[中圖分類號]R318[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）06-0941-04

組織工程概念的提出為修復(fù)軟骨組織的缺損提供了一種新的思路和方法。在組織工程軟骨的構(gòu)建中，大量的生長狀態(tài)良好的軟骨細胞以及合適支架材料起著十分關(guān)鍵的作用。近年的研究表明多種生物材料均可用于組織工程軟骨的構(gòu)建，各種材料均有各自的優(yōu)勢和缺點。我們嘗試將不同的材料進行復(fù)合，以彌補各自缺陷更好地構(gòu)建組織工程軟骨。本實驗采用BMG/生物蛋白膠和殼聚糖/明膠支架材料復(fù)合第一代軟骨細胞，篩選出更適合于構(gòu)建組織工程軟骨的支架材料。

1材料和方法

1.1 主要試劑與儀器：高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國GIBCO公司）；透明質(zhì)酸酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma 公司）；胎牛血清（Invitrogen 公司）；Ⅱ型膠原一抗（小鼠抗大鼠，Neomarker 公司）；Aggrecan 單克隆抗體（羊抗大鼠，Santa Cruz 公司）；殼聚糖/明膠（天津中醫(yī)藥大學(xué)）；BMG（第四軍醫(yī)大學(xué)骨科）；生物蛋白膠（廣州倍繡生物技術(shù)有限公司）；CO2 孵箱（Thermo 公司，美國）；熒光顯微鏡（Nikon,日本）。

1.2 實驗方法

1.2.1 SD大鼠肋軟骨細胞的培養(yǎng)[1]：SD 大鼠頸椎脫臼法處死，無菌操作臺取其肋軟骨組織，剝離軟骨膜，用眼科剪剪至1mm3左右的組織塊。采用三步法消化，獲得軟骨細胞, 37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)采用0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA（比例為1:1）進行消化，25㎝2培養(yǎng)瓶接種密度為105/ml。本實驗所采用的是第1代肋軟骨細胞。

1.2.2 軟骨細胞-支架復(fù)合物的構(gòu)建

1.2.2.1 殼聚糖/明膠-軟骨細胞復(fù)合物的構(gòu)建：無菌操作條件下，將輻射滅菌的材料取出，置于24孔細胞培養(yǎng)板中。調(diào)整軟骨細胞懸液濃度為1.0×107/ml，將50μl細胞懸液加入生物材料中（3mm×3mm×3mm），置于細胞培養(yǎng)箱中孵育4h，以使軟骨細胞附著于生物材料和培養(yǎng)板，加入2ml含20%胎牛血清高糖 DMEM培養(yǎng)液，每天半量更換培養(yǎng)液，共培養(yǎng)8周。

1.2.2.2 BMG /生物蛋白膠-軟骨細胞復(fù)合物的構(gòu)建：將松質(zhì)骨基質(zhì)浸泡于DMEM培養(yǎng)液中5min后取出，用滅菌濾紙吸干附在松質(zhì)骨基質(zhì)表面和網(wǎng)眼內(nèi)的水分，浸泡凝血酶后晾干。將纖維蛋白原主體膠與第 1代軟骨細胞混合，制成1×107/ml的細胞懸液，向材料上滴入纖維蛋白原細胞懸液50μl，加入DMEM培養(yǎng)液200μl，靜置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)10min。將軟骨模塊全部移至在24孔培養(yǎng)板中加入2ml含20%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液，置于5%CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每天半量更換培養(yǎng)液，共培養(yǎng)8周。

1.2.3 組織學(xué)觀察：分別于培養(yǎng)的不同時間點取出組織塊，4%多聚甲醛固定，常規(guī)制作切片，行HE、甲苯胺藍、Masson三色染色，光鏡觀察。

1.2.4 免疫學(xué)檢測：培養(yǎng)8周的組織塊4%多聚甲醛固定，Triton室溫下浸泡25min，0.01mPBS洗3次，每次5min；滴加一滴3%H2O2（無色液體），消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。0.01m PBS洗滌3次，每次3min；滴加一滴工作用血清（試劑A），常溫孵育15min，以消除非特異性染色；分別滴加（1:200）Ⅱ型膠原單克隆抗體、aggrecan抗體50μl，4℃冰箱過夜（>18h）；加入用免疫熒光染色二抗稀釋液稀釋熒光標記的二抗，培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育15min；0.01m PBS洗3次，每次5min；避光條件下于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 掃描電鏡觀察：取材培養(yǎng)2、4周的標本各一塊,2.5%戊二醛固定,梯度乙醇脫水，干燥，送檢掃描電鏡觀察支架材料表面軟骨細胞的黏附以及軟骨細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2實驗結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察結(jié)果：2周時可見軟骨細胞在BMG/生物蛋白膠材料表面以及內(nèi)部分布均勻，在殼聚糖/明膠材料表面分布的細胞稍多于BMG/生物蛋白膠，但內(nèi)部的細胞明顯少于材料表面（圖1）。隨著培養(yǎng)時間的延長，殼聚糖/明膠材料表面以及內(nèi)部細胞數(shù)量逐漸增多， 8周時該材料表面可見大量層疊狀軟骨細胞存在，各種染色顯示大量蛋白多糖和Ⅱ型膠原分泌。8周時BMG/生物蛋白膠處于降解階段，材料連續(xù)性中斷，軟骨細胞數(shù)量及細胞外基質(zhì)分泌量明顯少于殼聚糖/明膠材料（圖2）。

2.2 免疫熒光檢測

2.2.1 蛋白多糖染色: 8周時可見殼聚糖/材料呈現(xiàn)黃綠色深染，周圍為淡黃色或者黃綠色片染現(xiàn)象，與材料染色有明顯差別，隱約可見軟骨細胞形態(tài)（圖3）。而BMG/生物蛋白膠材料為淡黃色或者綠色染色，在材料表面及內(nèi)部軟骨細胞分布及染色情況清晰可見。

2.2.2 Ⅱ型膠原染色： 8周時殼聚糖/明膠材料熒光染色可見黃綠色深染的為殼聚糖/明膠材料，呈皺折狀，與HE染色形態(tài)一致，可明顯辨認，周圍為大量均勻分布的淡黃色或黃綠色片染現(xiàn)象為軟骨細胞分泌特征性Ⅱ型膠原熒光染色情況，隱約可見細胞形態(tài)。BMG/生物蛋白膠材料熒光染色見軟骨細胞分泌較多Ⅱ型膠原，染色為黃色或者黃綠色，但細胞數(shù)目明顯少于殼聚糖/明膠材料，片狀暈染現(xiàn)象不如后者明顯（圖3）。

2.3 電鏡觀察：2周時可見軟骨細胞黏附于BMG/生物蛋白膠支架材料的表面，細胞單個存在，開始伸展，偽足比較明顯（圖4A）；而殼聚糖/明膠材料表面可見少量的軟骨細胞黏附，細胞呈圓球形，各細胞之間接觸不緊密，細胞之間沒有細胞外基質(zhì)的存在形態(tài)（圖4B）。4周時可見：BMG/生物蛋白膠表面黏附有大量軟骨細胞，但細胞伸展狀態(tài)不佳（圖4C）；殼聚糖/明膠材料表面黏附軟骨細胞較少，細胞伸展狀態(tài)良好，呈現(xiàn)為長梭形或者樹枝狀，可見明顯的細胞周圍突起偽足以及細胞核形態(tài)（圖4D）。

3討論

3.1 松質(zhì)骨基質(zhì)（BMG）經(jīng)過脫鈣、去脂、去蛋白等處理，去掉了除BMP以外 95%非膠原蛋白和有阻滯作用的脂質(zhì)成分，降低了抗原性[2] ，同時松質(zhì)骨基質(zhì)還存留有少量BMP和其他促進骨軟骨形成的內(nèi)在生長因子[3]。但是單純的松質(zhì)骨基質(zhì)對軟骨細胞的吸附力并不強，軟骨細胞不易附在其上，軟骨細胞容易丟失，不易形成軟骨組織。生物蛋白膠又稱為纖維蛋白封閉劑，該物質(zhì)具有可塑性強，生物相容性好的優(yōu)點，為組織工程新軟骨形成提供一種可選擇的聚合物支架。Hommniga[4]等已經(jīng)在實驗中證實兔關(guān)節(jié)軟骨細胞能在人纖維蛋白凝膠中分裂增殖、合成基質(zhì)并保持其表型。纖維蛋白膠存在降解速度過快的缺點[5]，筆者嘗試將BMG/生物蛋白膠進行復(fù)合，后能夠彌補相互缺陷，更為符合組織工程材料的要求。

3.2 殼聚糖是一種源于動物的天然多糖，與細胞外基質(zhì)的糖胺聚糖分子結(jié)構(gòu)相似，具有很好的生物相容性[6]。殼聚糖帶有正電荷，使得材料表面與細胞膜之間發(fā)生非特異性吸附，從而有利于細胞在材料表面的黏附[7]，且其降解產(chǎn)物對人體無毒副作用[8]。但由于單純的殼聚糖材料親水性較差、降解速度慢等原因，已很難滿足組織工程的需要。許多學(xué)者嘗試將殼聚糖材料與多種材料進行復(fù)合，均取得了較好的結(jié)果[9-11]。由于殼聚糖親水性差，明膠可以促進細胞的黏附和生長，因此本研究考慮殼聚糖復(fù)合明膠，形成有利于細胞生長的細胞外基質(zhì)層結(jié)構(gòu)，可以促進細胞在材料表面的粘附和增殖。

3.3 體外培養(yǎng)8周后，可見兩種材料表面以及內(nèi)部均有蛋白多糖和Ⅱ型膠原的產(chǎn)生，提示在體外成功構(gòu)建組織工程軟骨。隨著培養(yǎng)時間的延長，蛋白多糖和Ⅱ型膠原的含量逐漸增多，但殼聚糖/明膠材料更為明顯，各種染色均顯示其陽性染色強于BMG/生物蛋白膠材料組。而培養(yǎng)2周時，常規(guī)染色兩種材料表面均有少量軟骨細胞的黏附且細胞分布均勻，殼聚糖材料內(nèi)部幾乎看不到軟骨細胞的存在，而BMG/生物蛋白膠材料內(nèi)部可見少量軟骨細胞呈圓形或者橢圓形均勻分布。分析其原因是由于軟骨細胞先與主體膠溶液混合均勻，再與吸附于BMG/生物蛋白膠支架上的凝血酶發(fā)生作用，形成纖維蛋白膠，這樣軟骨細胞主要包埋在纖維蛋白膠內(nèi)，均勻分布于BMG/生物蛋白膠支架表面以及網(wǎng)眼內(nèi)，從而使軟骨細胞有效地吸附和固定于支架內(nèi)，不易丟失；采用滴加法將軟骨細胞滴加在殼聚糖/明膠材料上，向材料內(nèi)部的滲透作用較弱，軟骨細胞主要分布于材料的表面。同時由于材料表面的氧氣和營養(yǎng)比內(nèi)部更充足，細胞更容易在殼聚糖/明膠材料表面生長，這與張世浩等[15]的研究一致。隨著培養(yǎng)時間的延長，兩種支架材料上細胞的數(shù)目均有顯著增加，軟骨細胞逐漸向材料內(nèi)部生長，分布更為均勻。電鏡觀察BMG/生物蛋白膠表面細胞明顯多于殼聚糖/明膠材料，可能是由于軟骨細胞黏附于殼聚糖/明膠材料的表面，在電鏡樣品制作過程中很容易脫落；但細胞伸展狀態(tài)不如殼聚糖/明膠材料，可能是生物蛋白膠材料降解速度過快，導(dǎo)致大量軟骨細胞的丟失，細胞數(shù)量減少，細胞外基質(zhì)分泌減少，使各細胞之間的連接、相互影響顯著降低[11]。

3.4 軟骨細胞在BMG/生物蛋白膠和殼聚糖/明膠材料上均能良好的生長，增殖。表明BMG/生物蛋白膠和殼聚糖/明膠材料均適合作為組織工程軟骨的支架材料，但體外研究表明殼聚糖/明膠材料優(yōu)于BMG/生物蛋白膠材料，其具體機制還需進一步進行體內(nèi)實驗。

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[收稿日期]2011-12-10[修回日期]2012-02-28

編輯/張惠娟