微針技術(shù)結(jié)合乙醇脂質(zhì)體促進重組人酸性成纖維細胞生長因子透皮吸收的研究

馮蘇云 范金財 劉立強等

[摘要]目的：探索rhaFGF透皮給藥微創(chuàng)有效的給藥方式。方法：離體實驗：亞甲藍染色經(jīng)微針處理后的離體兔皮，觀察微孔的分布和排列。冰凍切片HE染色觀察微孔的深度。在體實驗：新西蘭大白兔分別分為微針+空白脂質(zhì)體組、微針+rhaFGF組、微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組、皮內(nèi)注射組；時間和濃度一定時，皮膚組織切片免疫熒光、免疫組織化學染色觀察rhaFGF的分布，ELIsA法檢測皮膚組織勻漿液中rhaFGF的含量，經(jīng)統(tǒng)計后分析不同給藥方式中藥物經(jīng)皮滲透效果最好的一組。結(jié)果：微針處理后離體兔皮微孔排列均勻，深度可達真皮層。動物給藥30min后，微針+rhaFGF組、微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組及皮內(nèi)注射組皮膚組織勻漿液中rhaFGF含量均高于微針+空白脂質(zhì)體組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組高于微針+rhaFGF組皮膚組織勻漿液中rhaFGF含量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組及皮內(nèi)注射組組織勻漿液中rhaFGF含量無明顯差別(P>0.05)。rhaFGF免疫熒光、免疫組化染色顯示，微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組真皮組織中有大量rhaFGF存在，且分布均勻；結(jié)論：本文的研究結(jié)果表明微針技術(shù)結(jié)合乙醇脂質(zhì)體能取得較高的rhaFGF透皮效果，使rhaFGF外用給藥促進皮膚增殖，加速皮瓣擴張成為可能。此方法簡單易行，同時也為其它蛋白、多肽類大分子藥物的經(jīng)皮給藥研究提供了新思路。

[關(guān)鍵詞]重組人酸性成纖維細胞生長因子；乙醇脂質(zhì)體；微針陣列；經(jīng)皮給藥

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2012)07-1159-04

因大面積燒傷、創(chuàng)傷等因素引起的皮膚組織的缺損通常需要再生皮膚組織進行修復(fù)，目前可選用的方法有異體組織移植、組織工程、自體皮膚擴張轉(zhuǎn)移等，雖然異體組織移植、組織工程具有潛在的治療前景，但是目前僅有自體組織擴張術(shù)可再生出具有完全生理功能的皮膚組織。由于擴張產(chǎn)生的皮膚顏色、質(zhì)地、結(jié)構(gòu)和毛發(fā)均與受區(qū)相近似，是理想修復(fù)材料，并且擴張產(chǎn)生的皮瓣多數(shù)能保存感覺神經(jīng)，供區(qū)繼發(fā)畸形小，具有其它治療方法不可比擬的優(yōu)點，因此對于某些疾患如面頸部瘢痕的治療，皮膚擴張術(shù)已成為首選的治療方法。然而該技術(shù)存在治療周期長，再生皮膚有限，患者經(jīng)濟負擔較重等缺陷。目前人們也嘗試了各種辦法加速皮膚組織的生長，但是并沒有取得理想的效果。本研究旨在尋找一種新的、簡單易行的方法，加速皮膚組織再生，從而縮短治療周期，減輕患者負擔。

酸性成纖維細胞生長因子(acidic Fibroblast GrowthFactor，aFGF)是一種廣譜促分裂原，對來源于中胚層及神經(jīng)外胚層的細胞具有促增殖作用，能夠促進皮膚組織生長、新生血管形成。但是，目前尚沒有aFGF的外用制劑可以使aFGF穿透皮膚角質(zhì)層進入到皮膚組織內(nèi)。

微針陣列(microneddle array，簡稱微針)是近年來興起的一種新型的給藥方式，它利用微針組成的陣列可以在皮膚上人為造成數(shù)百上千條微米級的通道。這種通道是可見的，要比分子的尺寸大得多，并且通過角質(zhì)層延伸至表皮內(nèi)部，因此它可以很容易地讓大分子物質(zhì)通過；但是它并不會在皮膚上形成明顯的傷痕，通道一般也不觸及神經(jīng)及血管，在使用過程中不會引起疼痛感。目前微針在經(jīng)皮給藥領(lǐng)域中的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注。

微針促滲技術(shù)盡管在很大程度上減小了角質(zhì)層的傳導阻力，但是大分子多肽、蛋白類物質(zhì)的經(jīng)皮傳導仍是依靠濃差推動的被動擴散來實現(xiàn)的，由于藥物滯留、濃差極化、藥物在油水相分配系數(shù)的影響，滲透量仍然較低。要進一步提高藥物的經(jīng)皮滲透量，必須強化藥物的被動擴散，這可以通過改善藥物在臨時的局部傳輸區(qū)域、皮膚組織和組織液問的分配系數(shù)，增加新的推動力來實現(xiàn)。乙醇脂質(zhì)體是一種生物相容性很好的表面活性劑，可改善大分子多肽、蛋白類藥物在皮膚中的分配系數(shù)，使藥物的經(jīng)皮滲透性獲得顯著提高。

為了促進酸性成纖維細胞生長因子在外用給藥時可以穿過角質(zhì)層有效地進入真皮層內(nèi)，我們將近年來在經(jīng)皮給藥中具有優(yōu)良促滲作用的先進技術(shù)一乙醇脂質(zhì)體載體技術(shù)與微針技術(shù)相結(jié)合，使兩種方法共同作用，揚長避短，促進酸性成纖維細胞生長因子有效、大量地透過角質(zhì)層。同時本實驗也為大分子蛋白、多肽類物質(zhì)外用給藥提供了一種新的方法。

1材料和方法

1.1材料：新西蘭大白兔8只，清潔級，雌雄不限，5～6月齡，體重3.50～4.50kg，由中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院動物實驗中心提供，采用復(fù)層活動式兔籠籠養(yǎng)，飼養(yǎng)條件遵照國家相關(guān)規(guī)定和基本要求。飼養(yǎng)亦是由中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院動物實驗中心提供：購入后常規(guī)混合飼料喂養(yǎng)2周，無異常情況及病癥即投入使用。微針治療系統(tǒng)(長度1000μum，陣列密度均為30針／cm²，廣東高要市奇福微針有限公司)。重組人酸性成纖維細胞生長因子(recombinant humanacidic Fihroblast Growth Factor，rhaFGF)(艾夫吉夫，上海萬盛生物技術(shù)有限公司免費提供)。

L 2離體實驗

1.2.1微孔分布的觀察：新西蘭白兔2只，處死后取新鮮全厚兔皮，剃毛，用大頭釘固定于平木板上，保持自然張力，用微針處理后亞甲藍染色，10min后自來水沖洗、擦干，觀察微孔的分布，拍照記錄。

1.2.2微孔深度的測量和組織學觀察：將微針處理的離體兔皮，浸入OCT液中，存儲于-80℃低溫冰箱過夜，次日用低溫冷凍切片機切片(厚5μm)，HE染色，光學顯微鏡下觀察微針針道，并隨機選取50個針道測量其深度，求(x±s)，顯微成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.3在體實驗

1.3.1實驗動物預(yù)處理：術(shù)前1天，取新西蘭大白兔，在局麻下，用刀片剔去大白兔背部毛發(fā)。

1.3.2實驗動物分組：新西蘭白兔6只，麻醉，碘伏消毒2遍，取背部正中線，雙側(cè)對稱位置分別標記2cm×2cm大小的4塊皮膚。隨機分配給微針+空白脂質(zhì)體組、微針+rhaFGF組、微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組、皮內(nèi)注射組，共四組，每組1塊皮膚組織，6只兔，共48塊皮膚組織，每組分獲12塊皮膚組織。①微針+空白脂質(zhì)體組：每2cmX 2cm皮膚用微針交叉滾動2遍后涂布空白脂質(zhì)體：②微針+rhaFGF溶液組：每2cm×2cm皮膚用微針交叉滾動2遍后涂布濃度為0.06mg／ml rhaFGF溶液；③微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組：每2cm×2cm皮膚用微針交叉滾動2遍后涂布濃度為0.06mg／ml rhaFGF乙醇脂質(zhì)體；④皮內(nèi)注射rhaFGF組：每2cmX2cm皮內(nèi)多點注射濃度為0.06mg／ml rhaFGF溶液。

切取標記內(nèi)皮膚及皮下組織，部分標本用OCT液包埋，切片，aFGF免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察rhaFGF在皮膚組織中的分布；部分標本用10％甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，aFGF免疫組化染色，蘇木素復(fù)染，光學顯微鏡下觀察rhaFGF在皮膚組織中的分布；1cm×1cm皮膚組織ELISA法檢測皮膚勻漿液中rhaFOF的含量，分析藥物滲透進入皮膚組織內(nèi)的量，樣品組中微針+rhaFGF、組微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組、皮內(nèi)注射組稀釋十倍后再進行檢測。

1.3.3統(tǒng)計學方法：采用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。首先采用重復(fù)測量的方差分析進行各個數(shù)據(jù)比較，不同組樣本進行配對t檢驗。數(shù)據(jù)以均值±標準差(x±S)表示，設(shè)P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2結(jié)果

2.1大體觀察：微針處理的兔皮經(jīng)亞甲藍染色后，微孔被染成藍色，清晰、均勻分布，排列規(guī)則(圖1A，1B)。

2.2離體組織HF染色：光鏡下可見微針處理后的兔皮角質(zhì)層被刺穿，產(chǎn)生的微孔到達真皮層，平均深度(178±24)μm(圖2)。

2.3免疫組化、免疫熒光染色結(jié)果：經(jīng)皮給藥30min后，微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組可見兔皮膚真皮層大量的rhaFGF均勻分布，越靠近角質(zhì)層含量越高(圖3C1，C2)；皮內(nèi)注射組可見皮膚組織較為疏松，皮膚組織真皮層大量的rhaFGF，但分布并不均勻(圖3D1，D2)；微針組+rhaFGF溶液組可見有較少量rhaFGF(圖381，B2)；微針+空白脂質(zhì)體組未見rhaFGF(圖3A1，A2)。

2.4 ELISA結(jié)果：給藥30min后，微針+rhaFGF組、微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組及皮內(nèi)注射組皮膚組織勻漿液中rhaFGF含量均高于微針+空白脂質(zhì)體組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組高于微針+rhaFGF組皮膚組織勻漿液中rhaFGF含量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組及皮內(nèi)注射組組織勻漿液中rhaFGF含量無明顯差別(P>0.05)(表1)。

3討論

3.1皮膚角質(zhì)層是藥物透皮的主要屏障，僅允許分子量在500Da以下的脂溶性藥物擴散，如何使大分子物質(zhì)突破角質(zhì)層的限制成為藥物透皮研究的重點及熱點。近年發(fā)展的經(jīng)皮微針給藥技術(shù)，可以在角質(zhì)層產(chǎn)生大量的親水性微通道，使直接涂布無法透過的大分子親水性藥物到達真皮組織，是一種無痛微創(chuàng)高效的新興透皮技術(shù)。

3.2微針的長度是引起疼痛刺激的主要因素。有研究表明，在正常皮膚上，長度1500μm微針的疼痛刺激僅為26G微量注射針頭的35％。本實驗冰凍切片觀察到，1000μm微針處理后的離體皮膚平均深度為平均深度(178±24)μm，可能是由于皮膚的彈性回縮作用和滑動作用消減了微針的穿透力，使微針不能全部進入皮膚到達皮膚深層引起疼痛刺激。微針經(jīng)皮促透給藥不會引起疼痛刺激，相對于皮下注射是一種無痛、微創(chuàng)、安全可靠的方法。同時rhaFGF有促進創(chuàng)面愈合的作用，可能會加速小針道的愈合及收縮，減輕疼痛刺激。

3.3含醇脂質(zhì)體，又稱乙醇脂質(zhì)體，是近年來頗受藥學和皮膚領(lǐng)域關(guān)注的新型的柔性脂質(zhì)體，乙醇脂質(zhì)體藥物透皮給藥系統(tǒng)是藥劑學中的新興研究領(lǐng)域。乙醇脂質(zhì)體與普通脂質(zhì)體的主要區(qū)別在于乙醇包含在脂質(zhì)體囊泡中，沒有膽固醇的成分。磷脂是乙醇脂質(zhì)體雙分子層結(jié)構(gòu)中的主要化學成分，同時脂質(zhì)體含有相對較高體積分數(shù)的乙醇(約20％～50％)。乙醇的存在，降低了乙醇脂質(zhì)體囊泡的表面張力，增強脂質(zhì)體的柔性：另一方面，乙醇取代了脂質(zhì)雙分子層頭基附近的水分，從而提高其流動性；乙醇分子也改變角質(zhì)層間磷脂分子的緊密排列。角質(zhì)層磷脂雙分子層被改變結(jié)構(gòu)后容易與乙醇脂質(zhì)體囊泡的磷脂雙分子層相互融合，此時乙醇脂質(zhì)體囊泡將包封的藥物胞吐進入細胞間磷脂雙分子層；同時乙醇脂質(zhì)體也可以改變其形狀，以適應(yīng)變形的磷脂雙分子層的孔徑，然后滲透到達表皮或者真皮層。皮膚的附屬結(jié)構(gòu)毛囊和皮脂腺本身形似腔隙樣結(jié)構(gòu)，乙醇脂質(zhì)體囊泡本身可以變形成為細長結(jié)構(gòu)，然后通過毛囊皮脂腺單位。

3.4在乙醇脂質(zhì)體制備時，首先乙醇與磷脂相互作用，磷脂完全溶解在乙醇溶液中，磷脂分子充分伸展。當加入藥物時，隨著水相增加，乙醇所占比例的減少，磷脂分子自動排列形成單層片狀的有序結(jié)構(gòu)；當乙醇所占比例進一步減少，兩個磷脂分子側(cè)鏈便會相互交錯起來，使得大的片層結(jié)構(gòu)閉合起來形成了脂質(zhì)體囊泡。乙醇脂質(zhì)體包裹rhaFGF進入脂質(zhì)囊泡后，可有效避免rhaFGF與外界環(huán)境的直接接觸，對rhaFGF起到較好的保護作用。脂質(zhì)囊泡具有貯存藥物的作用，制成rhaFOF乙醇脂質(zhì)體后給藥，脂質(zhì)體外的游離的rhaFGF先發(fā)揮作用。之后，脂質(zhì)體囊泡中包裹的藥物從其中釋放，再次發(fā)揮藥效。通過兩次釋藥，脂質(zhì)體可以實現(xiàn)緩釋給藥的作用。實驗證明，與脂質(zhì)體相比乙醇脂質(zhì)體促藥物透皮吸收的效果更好。

3.5乙醇脂質(zhì)體除了具有一般脂質(zhì)體可生物降解，無毒性，不產(chǎn)生皮膚刺激性的優(yōu)點外，還具有以下功能：①可以與生物的細胞膜融合，將包裹的內(nèi)容物傳遞進入細胞膜內(nèi)；②易于變形從而穿透皮膚屏障的各種孔隙，如穿透角質(zhì)層間的磷脂層以及毛囊皮脂腺等；③乙醇脂質(zhì)體是一個兩性離子型表面活性劑，具有親油親水性，可以有效地包封各種化合物(脂溶性、水溶性分子包括蛋白質(zhì)多肽類分子)滲透到達皮膚深層。

3.6微針技術(shù)盡管在很大程度上減小了角質(zhì)層的傳導阻力，但是大分子多肽、蛋白類物質(zhì)的經(jīng)皮傳導仍是依靠濃度差推動的被動擴散實現(xiàn)的，由于藥物滯留、濃差極化、藥物在油水相分配系數(shù)的影響，藥物的滲透量仍然較低。磷脂是一種生物相容性很好的表面活性劑，可改善大分子多肽、蛋白類藥物在皮膚中的分配系數(shù)，使藥物的經(jīng)皮滲透性獲得顯著提高。本研究通過在體皮膚組織實驗可知：在微針的幫助下藥物可以透過皮膚層，微針+rhaFGF溶液組rhaFGF可以通過微針通道進入真皮層，分布也較均勻，但是數(shù)量較少。注射組真皮中有大量的rhaFGF，主要聚集在注射點周圍，分布不均勻。而微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組不僅毛囊和腺體中有rhaFGF，而且真皮層也有大量的rhaFGF均勻分布，提示微針與乙醇脂質(zhì)體聯(lián)合作用對rhFOF經(jīng)皮給藥的促透作用極佳。皮膚組織勻漿液中rhFGF含量測定結(jié)果進一步證實，微針+rhaFGF乙醇脂質(zhì)體組具有與皮內(nèi)多點注射組相當?shù)耐钙ば剩^微針+rhaFOF溶液組高，且差別顯著。微針技術(shù)與乙醇脂質(zhì)體載體技術(shù)相結(jié)合，發(fā)揮最大的功效，取得了較高的透皮速率。

3.7大分子物質(zhì)尤其是蛋白質(zhì)多肽類大分子物質(zhì)透皮吸收一直是人們研究的重點。乙醇脂質(zhì)體載體技術(shù)是近年來頗受藥學和皮膚領(lǐng)域關(guān)注的新型藥物載體，微針技術(shù)是物理經(jīng)皮給藥中具有優(yōu)良促滲作用的先進技術(shù)。將乙醇脂質(zhì)體載體技術(shù)與微針技術(shù)相結(jié)合，揚長避短，發(fā)揮最大的功效，從而取得較高的透皮速率。