重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子栓在大鼠和Beagle犬中的免疫原性

蔡永明 張春云 申文晉 李 銘 姜 凌 張宗鵬*

(1.天津藥物研究院天津市新藥安全評價研究中心，天津 300301;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院藥物分析學(xué)專業(yè)，天津 300193;3.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥代動力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193)

重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombi-nant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，rhGM-CSF)作用于造血祖細(xì)胞，促進(jìn)其增生和分化［1］，增強(qiáng)單核細(xì)胞抗原遞呈能力［2］，提高粒細(xì)胞和單核細(xì)胞抗體依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒［3］。rhGM-CSF臨床用于治療腫瘤病人因放射治療或化學(xué)治療引起的白細(xì)胞減少癥［4］;單獨(dú)或與抗真菌藥聯(lián)合使用可增強(qiáng)抗菌作用［5］;具有提高免疫、抗炎和促進(jìn)創(chuàng)面愈合功能［6-7］。rhGM-CSF栓經(jīng)陰道局部給藥，擬治療宮頸糜爛。為非臨床安全性評價的確切性提供依據(jù)，本課題組進(jìn)行了大鼠和Beagle犬的免疫原性試驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥物

重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子栓，長春金賽藥業(yè)股份有限公司提供。規(guī)格:①1.5 g/栓(藥物含量分別為0、0.87、3.46 和13.84 mg/g)，批號20060401，用于大鼠給藥;②8.0 g/栓(藥物含量分別為0、0.7、2.8和11.2 mg/g)，批號:20060510，用于 Beagle犬給藥。4℃保存。

1.2 檢測抗rhGM-CSF抗體的試劑

包被抗原為rhGM-CSF(HPLC純度:99.4%，濃度:1 mg/mL，批號:CG20050901)長春金賽藥業(yè)股份責(zé)任公司提供。大鼠免疫球蛋白(immunoglobulin G，IgG)和犬IgG由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠IgG，美國SBA公司產(chǎn)品;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗犬IgG，美國Rockland Immunochemicals公司產(chǎn)品。酶反應(yīng)底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB)和噻唑藍(lán)(MTT)為Sigma產(chǎn)品。TF-1(人紅白血病細(xì)胞)由中國藥品生物制品檢定所提供。RPMI 1640培養(yǎng)液為美國Gibco產(chǎn)品。96孔酶標(biāo)板和細(xì)胞培養(yǎng)板，均為美國Costar產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)用主要儀器

550型酶標(biāo)微板讀數(shù)儀，美國Bio-red公司產(chǎn)品。Columbus洗板機(jī)，奧地利TECAN公司產(chǎn)品。Thermo Scientific Sorvall ST 16R低溫離心機(jī)，美國Thermo公司產(chǎn)品。DKB-501A型恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物

①雌性SD大鼠(試驗(yàn)開始體質(zhì)量125～145 g)20只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SCXK(京)2002－0003，飼養(yǎng)環(huán)境為屏障系統(tǒng)。②雌性Beagle犬(6～8 kg)24只，安徽阜陽市維光實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SCXK(皖)06－001，全封閉觀察室，單籠飼養(yǎng)。本試驗(yàn)在優(yōu)良規(guī)范(good laboratory practice，GLP)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.5 受檢血清樣本

1.5.1 大鼠血清

rhGM-CSF栓大鼠長期毒性試驗(yàn)設(shè)0(賦形劑對照組)、0.24、0.96及3.84 mg/kg 4個組，本試驗(yàn)是對長期毒性試驗(yàn)中每組的5只大鼠定期跟蹤監(jiān)測抗體，包括給藥1、2、3個月和恢復(fù)1個月血清樣本。大鼠眼靜脈叢取血約0.8 mL，制備血清，－20℃保存。

1.5.2 Beagle犬血清

rhGM-CSF栓Beagle犬長期毒性試驗(yàn)設(shè)0(賦形劑對照組)、rhGM-CSF栓 0.07、0.28和1.12 mg/kg 4個組，每組6只動物。于給藥前、給藥期1個月、3個月及恢復(fù)期1個月從前肢隱靜脈采血約2 mL，制備血清，－20℃保存。

1.6 間接ELISA法測定抗rhGM-CSF抗體

將rhGM-CSF(抗原)用 pH 9.6的 Na2CO3-NaHCO3溶液稀釋成10 μg/mL濃度，包被于96孔酶標(biāo)板上，每孔100 μL，4℃過夜。用2% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉液37℃封閉2 h后，各孔加入100 μL經(jīng)10倍系列稀釋的待檢血清樣品;同時設(shè)陽性和陰性對照孔，37℃孵育1 h。洗滌后每孔加100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠IgG(1:10萬)或羊抗犬IgG(1:30萬)，37℃再孵育1 h。洗滌后各孔加100 μL酶反應(yīng)底物TMB，37℃反應(yīng)20～25 min。用2 mol/L硫酸50 μL終止反應(yīng)，在酶標(biāo)微板讀數(shù)儀上讀取各孔450 nm處的吸光值。

1.7 體外測活法鑒定抗體的中和活性

采用TF-1細(xì)胞(人紅白血病細(xì)胞)/MTT(噻唑藍(lán))比色法檢測抗體的中和活性。TF-1細(xì)胞系為rh-GM-CSF依賴型細(xì)胞，只有在rhGM-CSF存在情況下才可存活，若血清產(chǎn)生抗rhGM-CSF的中和抗體，中和了rhGM-CSF活性，則TF-1細(xì)胞不能存活。據(jù)此原理檢測血清產(chǎn)生抗rhGM-CSF抗體的中和活性。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔分別加入用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋濃度至2 ng/mL rhGM-CSF(50 μL)，分別取經(jīng)系列稀釋后的血清樣品50 μL，加入上述含有2 ng/mL rhGMCSF 96孔板培養(yǎng)板中，振蕩混合，37℃，作用1 h。然后各孔加入50 μL TF-1細(xì)胞懸液(4.0×105/mL)，37℃，5%CO2培養(yǎng) 40～48 h。每孔再加入 20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后加入100 μL裂解液，混勻后，在酶標(biāo)微板讀數(shù)儀上讀取各孔570 nm處的吸光度(參比波長為630 nm)。

1.8 陽性結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)及統(tǒng)計學(xué)方法

以同期賦形劑對照組動物血清標(biāo)本所測得吸光值的2.1倍作為產(chǎn)生抗體的閾值，凡給藥后血清標(biāo)本測得的吸光值大于或等于閾值者，判定為陽性。各劑量組動物血清中所測的結(jié)合抗體和中和抗體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以抗體滴度對數(shù)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，滿足正態(tài)性分布數(shù)據(jù)用單因素方差分析法進(jìn)行組間比較，同時進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)(若方差齊性，用LSD法;方差不齊性，用Tamhane's T2法)。不滿足正態(tài)性的數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗(yàn)中的多組秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H法)。計數(shù)資料采用交叉表χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher單側(cè)精確檢驗(yàn)(總頻數(shù)N＜40)。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 ELISA法檢測結(jié)果

2.1.1 大鼠血清樣本測定結(jié)果

抗體監(jiān)測試驗(yàn)結(jié)果表明，在大鼠重復(fù)陰道給予rhGM-CSF栓3個月的長期毒性試驗(yàn)中，從給藥1個月(以下簡稱M1)起一直持續(xù)到恢復(fù)期結(jié)束(以下簡稱rM1)，0.24、0.96和3.84 mg/kg 3個劑量組動物血清中均能檢測到抗rhGM-CSF的抗體。在給藥2個月(以下簡稱M2)后抗體強(qiáng)度有逐漸增強(qiáng)的趨勢，并在給藥期3個月(以下簡稱M3)至恢復(fù)期內(nèi)抗體強(qiáng)度變化不大。在給藥的第1個月和第2個月時，高劑量組動物血清所檢測到的抗體滴度明顯高于低劑量組和中劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，低、中劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果詳見表1、表2和圖1。

表1 大鼠重復(fù)陰道給予rhGM-CSF栓后產(chǎn)生抗體的動物比例(產(chǎn)生抗體動物數(shù)/總動物數(shù))Tab.1 The incidence of anti-rhGM-CSF antibodies in rats vaginally administered rhGM-CSF suppository(ratio of positive to total animals)

表2 ELISA法測定大鼠重復(fù)陰道給予rhGM-CSF栓后抗rhGM-CSF結(jié)合抗體的形成Tab.2 The titer of anti-rhGM-CSF binding antibodies in the sera of the rats were determined during the treatment and recovery periods by ELISA method (，n=5)

表2 ELISA法測定大鼠重復(fù)陰道給予rhGM-CSF栓后抗rhGM-CSF結(jié)合抗體的形成Tab.2 The titer of anti-rhGM-CSF binding antibodies in the sera of the rats were determined during the treatment and recovery periods by ELISA method (，n=5)

*P ＜0.05 vs group of 3.84 mg/kg;M1:treated with rhGM-CSF for one month;M2:treated with rhGM-CSF for two months;M3:treated with rhGM-CSF for three months;rM1:recovery period for one month;rhGMCSF:recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.

Doses(mg·kg_－1)_____________Log titer of treatment M1 M2 M3____Log titer of recovery rM1 0————0.24 2.00 ±0.00* 2.60 ±0.55 2.60 ±0.55 2.40 ±0.89 0.96 1.80 ±0.84* 2.20 ±1.10*2.40 ±0.89 2.60 ±0.55___3.84______3.00 ±0.00____3.60 ±0.55___3.40 ±0.8____________9_3.00±0.00

圖1 ELISA法測定大鼠陰道給藥血清中產(chǎn)生抗rhGM-CSF結(jié)合抗體滴度(，n=5)Fig.1 The titer of anti-rhGM-CSF binding antibodies in the sera of the rats were determined during the treatment and recovery periods using ELISA(，n=5)

2.1.2 Beagle犬血清樣本測定結(jié)果

Beagle犬各劑量組在給藥前、給藥后1個月和3個月(停藥次日)及恢復(fù)期1個月，各劑量組動物血清采用ELISA方法所測得的吸光值均低于同期賦形劑對照組抗體的閾值，表明血清中沒有檢測到抗rhGMCSF的結(jié)合抗體。

2.2 中和抗體檢測結(jié)果

對采用ELISA方法檢測出產(chǎn)生結(jié)合抗體的血清樣品，進(jìn)行抗體中和活性測定，以觀察所產(chǎn)生的結(jié)合抗體是否為中和抗體。體外活性測定結(jié)果顯示，各劑量組在給藥1個月開始就有部分動物產(chǎn)生中和抗體;高劑量組在給藥2個月開始全部動物都產(chǎn)生中和抗體，一直持續(xù)到恢復(fù)期結(jié)束，中和活性滴度(滴度的對數(shù))在1.80～2.05間(滴度的對數(shù));低、中劑量組則在恢復(fù)期結(jié)束才全部產(chǎn)生中和抗體;恢復(fù)期結(jié)束三個劑量組中和抗體滴度(滴度的對數(shù))范圍在1.02～2.05間。結(jié)果詳見表3、表4和圖2。

表3 大鼠重復(fù)陰道給予rhGM-CSF栓血清中產(chǎn)生中和抗體的比例(產(chǎn)生中和抗體動物數(shù)/總動物數(shù))Tab.3 The incidence of neutralizing antibodies in rats vaginally administered rhGM-CSF suppository(ratio of positive to total animals)

M1:treated with rhGM-CSF for one month;M2:treated with rhGMCSF for two months;M3:treated with rhGM-CSF for three months;rM1:recovery period for one month;rhGM-CSF:recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.

表4 rhGM-CSF栓大鼠給藥不同時期血清中抗體的中和活性滴度Tab.4 The titer of neutralizing antibodies in the sera of the rats were determined during the treatment and recovery periods(，n=5)

表4 rhGM-CSF栓大鼠給藥不同時期血清中抗體的中和活性滴度Tab.4 The titer of neutralizing antibodies in the sera of the rats were determined during the treatment and recovery periods(，n=5)

*P ＜0.05 vs group of 0.96 mg/kg;#:P ＜0.05 vs group of vs 0.24 mg/kg;M1:treated with rhGM-CSF for one month;M2:treated with rh-GM-CSF for two months;M3:treated with rhGM-CSF for three months;rM1:recovery period for one month;rhGM-CSF:recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.

Doses/(mg·kg_－1)Log titer of treatment M1 M2 M3 Log titer of recovery rM1 0 0 0 0 0 0.24 0.421 ±0.404 1.806 ±1.021 1.445 ±0.252 1.024 ±0.457 0.96 0.120 ±0.269 0.843 ±0.779 0.843 ±0.779 1.626 ±0.269#_3.84___0.602 ±0.476 2.047 ±0.495*1.806 ±0.476*2.047 ±0.5__38#

圖2 rhGM-CSF栓大鼠給藥不同時期血清中和抗體滴度Fig.2 The titer of neutralizing antibodies in the sera of the rats were determined during the treatment and recovery periods using bioassay method(，n=5)

3 討論

rhGM-CSF是一種基因工程藥物，其主要作用是刺激粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的成熟，促進(jìn)成熟細(xì)胞向外周血釋放［8］，rhGM-CSF可增加機(jī)體免疫力，對抗炎性反應(yīng)［9］。rhGM-CSF作為重組蛋白或多肽類生物技術(shù)藥物對非同源的動物而言具有免疫原性，所產(chǎn)生的抗體是否有中和活性視藥物和動物而異［10］。在重復(fù)給藥的毒性試驗(yàn)中，如果出現(xiàn)具有中和活性的抗體會減弱藥物的藥理作用，干擾毒性反應(yīng);而抗原抗體復(fù)合物的產(chǎn)生又可能會出現(xiàn)新的毒性反應(yīng)［11-12］。因此監(jiān)測抗體的產(chǎn)生和中和活性的強(qiáng)弱十分重要。大鼠重復(fù)陰道給予rhGM-CSF栓3個月的試驗(yàn)中，血清中能檢測到抗rhGM-CSF的抗體，并且所檢測到的抗體具有中和活性，表明rhGM-CSF對大鼠具有較強(qiáng)的免疫原性。該免疫原性會減弱藥物的活性以及與活性相關(guān)的毒性，可能會影響rhGM-CSF毒性的判斷。所產(chǎn)生的抗原抗體免疫復(fù)合物是否會在腎臟產(chǎn)生沉積，宜進(jìn)一步用免疫組化方法來證實(shí)［13］。在Beagle犬體內(nèi)未檢測到抗rhGM-CSF的抗體產(chǎn)生，采用Beagle犬作為實(shí)驗(yàn)動物模型進(jìn)行長期毒性試驗(yàn)以評價rhGMCSF栓重復(fù)給藥毒性，會更能反映藥物毒性暴露，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

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