酶法降解茶葉多糖技術(shù)研究

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 黃世霞 王在貴＊ 劉學(xué)詩(shī)

茶葉多糖（tea polysaccharides，TPS）是從茶葉中提取出來(lái)的多糖類復(fù)合物，具有降血糖、降血脂、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等多種生物學(xué)功能 （招鈺等，2007；李布青等，1996）。其相對(duì)分子質(zhì)量為40000～100000，易溶于熱水，不溶于高濃度的有機(jī)溶劑（徐仲溪和王坤波，2004）。茶多糖的溶解性是其性質(zhì)的一項(xiàng)很重要的指標(biāo)，一般多糖分子質(zhì)量越大，溶解性越低，不利于多糖穿越多重細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，從而影響其生物活性（Chen等，2009）。而低分子質(zhì)量的多糖易于腸壁細(xì)胞結(jié)合，具有抑制有害菌，阻止腸道毒素的吸收等生理功能。目前關(guān)于低分子質(zhì)量的茶葉多糖的制備及其生理活性的研究仍鮮有報(bào)道。本研究利用酶法降解茶多糖降低其聚合度，并研究了最適酶解參數(shù)，以期為茶葉低聚糖的制備及其生理活性的研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 茶葉多糖（由本實(shí)驗(yàn)室提供），纖維素酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶（由某生物股份有限公司提供，于-30℃冰箱中保存）。檸檬酸、磷酸氫二鈉、苯酚、酒石酸鉀鈉、羧甲纖維鈉、3，5-二硝基水楊酸（DNS）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取0.1 mg/mL 葡 萄 糖 溶 液 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL依次加入試管中，分別補(bǔ)加入蒸餾水至1.5 mL。每管中加3 mL DNS于沸水中煮10 min，自來(lái)水冷浴冷卻，加入10 mL蒸餾水稀釋混勻，于550 nm處進(jìn)行比色測(cè)定，用空白管調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定OD550，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D550為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。每組2個(gè)平行。（注：每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）。

1.2.2 茶葉多糖最適降解酶的篩選 取5 mg/mL茶葉多糖1 mL，分別加入0.5 mL木聚糖酶，0.5 mL纖維素酶，0.5 mL β-葡聚糖酶和0.5 mL混合酶液（1 mL β-葡聚糖酶與3 mL纖維素酶混合），40℃水浴10 min，然后分別加入3 mL水楊酸，迅速放到沸水中水浴10 min，冷卻，再分別加10 mL去離子水搖勻，測(cè)定OD550。

1.2.3 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的最適溫度設(shè)定恒溫水浴鍋溫度分別為 30、35、40、45、50、55、60、65℃和70℃；茶葉多糖濃度為5 mg/mL，pH 7.0，反應(yīng)時(shí)間為 10 min，測(cè)定 OD550。

1.2.4 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的熱穩(wěn)定性測(cè)定 將β-葡聚糖酶分別放到60、70℃水浴鍋中保存 10、20、30、60、120、180、240 min， 每個(gè)時(shí)間終點(diǎn)取出1.5 mL酶液，按照上述方法測(cè)定OD550。

1.2.5 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖最適pH 用pH 分別為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖液配置濃度為5 mg/mL的茶葉多糖溶液，酶解溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為10 min，測(cè)定OD550。

1.2.6 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖pH穩(wěn)定性測(cè)定用 pH 分別為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液適當(dāng)稀釋?duì)?葡聚糖酶，37℃下水浴16 h后，測(cè)定各處理樣品降解茶葉多糖的OD550。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=0.6071x-0.0057，R2=0.9954。

2.2 茶葉多糖最適降解酶篩選結(jié)果 用木聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶以及纖維素酶與β-葡聚糖酶的混合酶液分別降解茶葉多糖，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，β-葡聚糖酶能很好的降解茶葉多糖，纖維素酶次之，復(fù)合酶液效果較差，木聚糖酶最差。

圖1 不同酶液對(duì)茶葉多糖的降解效果的影響

2.3 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的最適溫度 用pH 7.0緩沖液配制的茶葉多糖溶液，在不同溫度（30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃） 條件下測(cè)定β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的活力，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，β-葡聚糖酶降解茶葉多糖反應(yīng)最適溫度為40℃，合適反應(yīng)溫度為35～45℃。

2.4 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖熱穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果 在不同溫度條件下，于不同的時(shí)間點(diǎn)取出部分酶液測(cè)定酶解茶葉多糖能力，以未經(jīng)過(guò)處理的酶液為對(duì)照，計(jì)算剩余活力，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)降解的茶葉多糖在60、70℃條件下，隨時(shí)間的延長(zhǎng)酶活均會(huì)逐漸下降，70℃條件下保溫120 min已無(wú)酶活，60℃條件下保溫180 min酶活消失。

圖2 不同溫度對(duì)β-葡聚糖酶酶解茶葉多糖效果的影響

圖3 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的熱穩(wěn)定性

2.5 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的最適pH 在不同pH條件下測(cè)定β-葡聚糖酶降解茶葉多糖后的OD550值，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的最適pH為7.0，合適pH范圍為6.0～8.0。

圖4 不同pH對(duì)β-葡聚糖酶酶解茶葉多糖效果的影響

2.6 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果 由圖5可知，在pH為4.0～7.0酶活穩(wěn)定上升，而當(dāng)pH高于7.0時(shí)酶活開始下降。pH為6.0～7.0酶活較穩(wěn)定。

3 討論

圖5 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的pH穩(wěn)定性

木聚糖酶是降解木聚糖的β-1，4糖苷鍵的水解酶。纖維素酶為多種水解酶組成的復(fù)合酶系，可分解葡聚糖的β-1，4糖苷鍵；β-葡聚糖酶可催化水解葡聚糖的β-1，4糖苷鍵和β-1，3糖苷鍵。本研究結(jié)果表明，纖維素酶和β-葡聚糖酶相對(duì)木聚糖酶具有較強(qiáng)分解茶葉多糖的能力，其中β-葡聚糖酶酶解效果最佳。由此可見(jiàn)，茶葉多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)存在一定β-1，3-糖苷鍵連接。

本研究對(duì)β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的主要特性進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。吳琪等（2011）研究表明，β-葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫為40～50℃，最適反應(yīng)pH為7.5。郭雨桐和肖文軍（2011）研究發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖酶降解茯苓多糖的最適反應(yīng)溫度為55℃，最適pH為5.5。本試驗(yàn)結(jié)果表明，β-葡聚糖酶對(duì)茶葉多糖降解的最適溫度為40℃，最適pH為7.0。戴易興等（2011）利用乳糖誘導(dǎo)基因工程菌產(chǎn)的β-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性較好，在70℃左右下活力較高。關(guān)于降解茶葉多糖的最適酶及酶解體系仍需做進(jìn)一步研究。

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