腦缺血大鼠腦組織中強(qiáng)啡肽A（1－8）含量及含水量的變化＊

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院（西安710004）

展淑琴△ An Zhou△ Tao Yang△ 郭新奎 黃 芳

強(qiáng)啡肽（DYN）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布于腦與脊髓中的一類重要的神經(jīng)遞質(zhì)，DYN對κ受體的選擇性較強(qiáng)，它是一種與應(yīng)激有關(guān)的神經(jīng)肽，有研究證實急性腦缺血不同時期腦、腦脊液和血液中內(nèi)源性阿片肽濃度均發(fā)生明顯變化，表明內(nèi)源性阿片肽在缺血性腦損傷的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。強(qiáng)啡肽A（1－8）［DYN－A（1－8）］是一種含8個氨基酸的短鏈多肽，我們既往的研究發(fā)現(xiàn)給腦缺血小鼠腦室內(nèi)注射合成的 DYN－A （1－8）可明顯縮小腦梗死面積［1］，為觀察局灶性腦缺血大鼠腦皮層及紋狀體中DYN－A（1－8）含量的變化及局灶性腦缺血大鼠腦皮層及紋狀體含水量的變化，我們進(jìn)行了此項研究，現(xiàn)報道如下。

材料和方法

1 動物及組織準(zhǔn)備 用大腦中動脈阻塞（MCAO）的方法建立短暫性局灶性腦缺血模型［2］。雄性Sprague－Dawley大鼠（體重250～300g）48只，購自Charles River Laboratories，大鼠在含700ml/L 一氧化二氮、300ml/L氧的氣體中被40ml/L異氟烷麻醉，并以20ml/L異氟烷維持。MCAO組24只，通過引導(dǎo)一根3－0的絲線進(jìn)入一側(cè)頸內(nèi)動脈腔，同時結(jié)扎頸外動脈及頸內(nèi)動脈顱外段制造大腦中動脈阻塞模型，絲線在100min后被撤出并使再灌注達(dá)24h，在再灌注結(jié)束時間點（8h及24h），每組各12只大鼠在麻醉狀態(tài)下被斷頭取腦，其中6只全腦立即在干冰上冷凍－80℃保存?zhèn)溆?，?只分離皮層及紋狀體后進(jìn)行皮層及紋狀體含水量的測定。假手術(shù)對照組24只（8h及24h時間點各12只），麻醉、血管分離同上，但不行線拴及動脈結(jié)扎，余同MCAO組，其中6只全腦立即在干冰上冷凍，－80℃保存?zhèn)溆?，?只分離皮層及紋狀體后進(jìn)行皮層及紋狀體含水量的測定。

2 腦組織處理 分離缺血側(cè)腦皮層及紋狀體組織，樣品稱重后勻漿處理，腦組織勻漿用含1mM EDTA及蛋白酶抑制劑的0.1MHCl緩沖液處理，100℃煮沸15min并立即在冰上冷卻后于4℃13000rpm離心20min，吸上清液入一套新管，用Bradford法（Sigma－Aldrich）測定所有樣本的蛋白濃度。

3 DYN－A（1－8）的放免測定 取含55μg蛋白的上清液行真空離心140min，真空抽干后的樣本用放免法測定DYN－A （1－8）含量（pmol/g brain tissue；mean±s）。放免試劑盒購自Peninsula Laboratories inc。

4 腦含水量的測定 將大鼠斷頭取腦，剔除低位腦干及小腦，分離左右半腦，用濾紙吸去腦表面的水分，分離缺血側(cè)皮層及紋狀體后取各缺血側(cè)皮層及紋狀體組織裝入稱量瓶，電子分析天平稱取各組各約120mg濕重的缺血側(cè)皮層或紋狀體組織 （精確到0.1mg），然后置于干燥箱內(nèi)100℃烘24h至恒重后再稱干重，按下列公式計算腦含水量：腦含水量（%）＝（濕重－干重）/濕重×100%。

結(jié) 果

1 DYN－A（1－8）含量的變化 見表1。隨再灌注時間的延長，缺血腦皮層及紋狀體內(nèi)DYN－A（1－8）的含量逐漸下降。

表1 腦缺血后再灌注8h及24h大鼠缺血側(cè)腦皮層及紋狀體內(nèi)強(qiáng)啡肽A（1－8）含量的變化（pmol/g，±s）

表1 腦缺血后再灌注8h及24h大鼠缺血側(cè)腦皮層及紋狀體內(nèi)強(qiáng)啡肽A（1－8）含量的變化（pmol/g，±s）

注：與假手術(shù)對照組在同一部位及同一時間點相比aP＜0.05，與再灌注8h大鼠在同一部位相比bP＜0.05

8h（n＝6）24h（n＝6）組 別皮層 紋狀體假手術(shù)對照組 5.58±0.61 7.72±0.92皮層 紋狀體5.43±0.52 7.59±0.88腦缺血組 3.51±0.43a 5.62±0.71a 2.41±0.32ab 4.35±0.63ab

2 腦皮層及紋狀體含水量的變化 見表2。缺血側(cè)再灌注8h及24h的腦皮層及紋狀體含水量均明顯增加，與假手術(shù)對照組相比有顯著性差異（P＜0.05），且再灌注24h的缺血側(cè)腦皮層及紋狀體含水量較再灌注8h增加，差異有顯著性（P＜0.05）。

表2 腦缺血后再灌注8h及24h大鼠缺血側(cè)腦皮層及紋狀體含水量的變化 （%）

討 論

內(nèi)源性阿片肽包括內(nèi)啡肽、DYN、腦啡肽、內(nèi)嗎啡肽以及孤啡肽，它們存在于腦組織、腦脊液及血液中，是體內(nèi)具有阿片樣活性的一組物質(zhì)，在體內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)和激素的功能，對機(jī)體的心血管功能、內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)以及消化系統(tǒng)、鎮(zhèn)痛、呼吸系統(tǒng)等都有重要的調(diào)節(jié)作用。DYN包括DYN－A、DYN－B及α－新內(nèi)啡肽。DYN－A是Goldstein等1979年從豬垂體中提取的一種阿片樣活性極強(qiáng)的17肽DYN，DYN－B是1982年Goldstein和Udenfriend分別發(fā)現(xiàn)的另一種13肽DYN，其N末端還經(jīng)一對堿性氨基酸與上述17肽DYN的C末端相接，它們在腦和脊髓內(nèi)有廣泛分布，其功能復(fù)雜多樣。它是一種與應(yīng)激有關(guān)的神經(jīng)肽，DYN對κ受體選擇性強(qiáng)，被認(rèn)為是κ受體的內(nèi)源性配體。近20多年來，對阿片肽的研究一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點問題之一，內(nèi)源性阿片肽在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用也取得了很大進(jìn)展。其中作為內(nèi)源性阿片肽的β－內(nèi)啡肽、DYN和腦啡肽與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷有著密切的關(guān)系。近年來，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為β－內(nèi)啡肽、DYN－A、亮氨酸腦啡肽參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的繼發(fā)性損傷［3］。腦啡肽參與了腦血管疾病的病理生理過程，引起一系列神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀。有研究證實急性腦缺血不同時期腦、腦脊液和血液中內(nèi)源性阿片肽濃度均發(fā)生明顯變化，表明內(nèi)源性阿片肽在缺血性腦損傷的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。DYN參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的繼發(fā)延遲性病理損害過程，是阿片肽中作用最強(qiáng)的一種［4］。

本研究在假手術(shù)對照組大鼠及100min MCAO后再灌注8h缺血側(cè)腦皮層及紋狀體強(qiáng)啡肽A（1－8）的含量分別是5.58±0.61及3.51±0.43pmol/g，7.72±0.92及5.62±0.71pmol/g，假手術(shù)對照組大鼠及再灌注24h大鼠缺血側(cè)腦皮層及紋狀體強(qiáng)啡肽A（1－8）的含量分別是5.43±0.52及2.41±0.32pmol/g，7.59±0.88及4.35±0.63pmol/g，隨再灌注時間的延長，缺血側(cè)腦皮層及紋狀體中強(qiáng)啡肽A（1－8）的含量逐漸下降（P＜0.05）。

從本實驗結(jié)果看出短暫腦缺血后再灌注8h即出現(xiàn)缺血側(cè)腦皮層及紋狀體中DYN－A（1－8）含量的減少，且隨著再灌注時間的延長，DYN－A（1－8）的含量進(jìn)一步減少。我們的研究還發(fā)現(xiàn)在100min MCAO后，隨再灌注時間的延長，缺血側(cè)腦皮層及紋狀體含水量增加，即隨再灌注時間的延長DYN－A（1－8）含量減少的同時伴有腦皮層及紋狀體水腫的加重。

DYN－A（1－8）由前蛋白轉(zhuǎn)化酶PC2發(fā)揮蛋白水解作用而來，既往我們的研究中發(fā)現(xiàn)小鼠腦室內(nèi)注射合成的 DYN－A（1－8）可明顯縮小腦梗死面積［1］，提示DYN－A（1－8）在腦缺血時具有保護(hù)作用，具有治療腦梗死的潛力。Silvia等［5］也證明DYN－A能夠明顯改善貓腦缺血后的神經(jīng)機(jī)能缺損程度，延長生存時間，減輕腦組織損傷。另有些研究也發(fā)現(xiàn)沙土鼠側(cè)腦室注射DYN－A后缺血大腦皮層Ca2＋含量大量降低，腦水腫明顯減輕［6］；超低濃度的 DYN－A（1－8）顯著阻止脂多糖引起的LDH釋放、神經(jīng)元的缺失及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變［7］；在單側(cè)腦缺血沙土鼠模型，DYN治療可明顯改善運動功能障礙［8］。

DYN－A （1－8）除與缺血性腦損傷關(guān)系密切外，還與癡呆、衰老、高血壓等有關(guān)。Sunderland等［9］發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者腦脊液DYN－A（1－8）水平較對照降低了40%，DYN－A（1－8）有延緩細(xì)胞衰老的作用。Berman等［10］發(fā)現(xiàn)限制食物可增加伏核、終紋床核、外側(cè)下丘腦的DYN－A（1－8）水平。海馬的DYN系統(tǒng)與孤立引起的高血壓的維持有關(guān)［11］，海馬內(nèi)的 DYN－A（1－8）通過中樞機(jī)制降低動脈血壓。因此DYN－A（1－8）作用廣泛，與多種疾病密切相關(guān)。

Kao等［12］的研究認(rèn)為DYN－A有對抗腦缺血時腦水腫的作用，能使缺血后腦重量減少到缺血前水平，多項研究表明DYN－A（1－8）在腦缺血時具有腦保護(hù)作用，因此我們認(rèn)為DYN－A（1－8）含量的減少會加重腦水腫，影響腦缺血后腦神經(jīng)細(xì)胞的存活，DYN－A（1－8）具有臨床治療腦梗死的潛力。

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