山西省玉米穗腐病病原鐮孢菌的分離與鑒定

李新鳳，王建明，張作剛，高俊明，郝曉娟，賀運(yùn)春

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801）

玉米是全世界廣泛分布的糧食作物之一，同時(shí)也是重要的飼料來源。在其生長(zhǎng)過程中不可避免地要受到多種病原物的侵染。玉米穗腐病又稱玉米穗粒腐病，是玉米生長(zhǎng)后期最常見的病害之一。近年來，由于玉米品種不斷更新，栽培管理措施不當(dāng)，以及氣候因素等的影響，導(dǎo)致該病呈逐年加重的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著我國(guó)的玉米生產(chǎn)。引起玉米穗腐病的病原菌有多種，其中鐮孢菌是引起該病的主要病原菌，該菌不僅可以直接侵染玉米對(duì)玉米造成危害，其分泌的毒素還可以引起人畜中毒，嚴(yán)重影響玉米的安全性。

近年來，有關(guān)玉米穗腐病病原鐮孢菌的研究很多。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不同地理區(qū)域的玉米種植區(qū)，玉米穗腐病病原鐮孢菌的種群結(jié)構(gòu)不同［1］，其中歐洲、非洲等地的研究表明，該病的主要致病菌為輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides；異名串珠鐮刀菌F.moniforme）、層出鐮刀菌（F.proliferatum）和膠孢鐮刀菌（F.subglutinans）［2～4］。我國(guó)的研究普遍認(rèn)為，引起該病的優(yōu)勢(shì)病原菌為輪枝鐮刀菌（F.verticillioide），其次是禾谷鐮刀菌（F.gram inearum）［5～7］。明確玉米穗腐病的病原菌的種群結(jié)構(gòu)對(duì)于玉米穗腐病的有效防控具有重要的指導(dǎo)意義。

玉米也是山西省的主要栽培作物之一，近年來玉米穗腐病的發(fā)生很普遍，但未見有關(guān)山西省玉米穗腐病病原鑒定的報(bào)道。為明確山西省該病的病原菌種類，從2010年開始對(duì)山西省不同地區(qū)的玉米穗腐病進(jìn)行了調(diào)查，并對(duì)該病的病原菌進(jìn)行了分離、純化與鑒定，旨在為該病的流行規(guī)律、抗病育種及相關(guān)領(lǐng)域的研究提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試品種

供試玉米品種為M26，該品種易感穗腐病。

1.1.2 培養(yǎng)基

Armstrong液體培養(yǎng)基：

葡萄糖20.0g，MgSO4·7H2O 0.4g，KCl 1.6g，KH2PO41.1g，Ca（NO3）25.9g，F(xiàn)eSO40.2 mg·L－1，MnSO40.2mg·L－1，ZnSO40.2mg·L－1，去離子水1000mL。

康乃馨葉片培養(yǎng)基（CLA）［8，9］：

瓊脂20g，水1L，康乃馨葉片適量。將3～5 mm2大小的無菌康乃馨葉片，放入冷卻到45℃的滅菌水瓊脂平板表面，一般情況下，9cm大的培養(yǎng)皿內(nèi)加入10～12塊即可。接種時(shí)，菌塊要靠近康乃馨葉片。

Spezieller N¨ahrstoffarmer 瓊 脂 培 養(yǎng) 基（SNA）［10］：

KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，KNO31g，KH2PO41g，蔗糖0.2g，葡萄糖0.2g，瓊脂20g，蒸餾水1L。將滅菌培養(yǎng)基倒平板，待平板冷卻后，在平板表面，放入1～2片濾紙條。

2%水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：

瓊脂20g，自來水1L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病株采集與病原菌分離

2010年9月，于山西省晉城市與太谷縣兩地選取玉米穗腐病發(fā)病重的病株，采集玉米穗腐病病穗20余份，利用常規(guī)組織分離法，對(duì)采集病樣的病粒和穗軸上的病原菌進(jìn)行了分離純化：將玉米病粒置于70%酒精中浸泡幾秒鐘，取出后用無菌水沖洗干凈，滅菌濾紙吸干表面的水份，然后用無菌刀片將其切成小塊，置于2%的水瓊脂平板表面，每平板4～5塊，之后置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。穗軸上的病原菌分離，則無需進(jìn)行表面消毒，可切開穗軸，直接切取穗軸里面的小塊組織，置于2%的水瓊脂平板中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，用稀釋平板法進(jìn)行單孢分離。然后利用形態(tài)學(xué)分類方法對(duì)單孢分離物進(jìn)行初步鑒定、編號(hào)，并記錄不同種鐮孢菌的分離頻率。

鐮孢菌的分離頻率＝（所得菌種株數(shù)／分離組織塊數(shù)）×100%。

1.2.2 病原菌的形態(tài)鑒定

經(jīng)單孢分離后的培養(yǎng)物，接種到CLA、SNA、PDA培養(yǎng)基上，依據(jù)菌株生長(zhǎng)速率的差異，在適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4～10天后，依次記錄各項(xiàng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用于該鐮孢菌種的鑒定。

培養(yǎng)性狀觀察：

包括在PDA培養(yǎng)基上菌落的質(zhì)地、顏色，基質(zhì)顏色。色澤名稱根據(jù)《色譜》一書進(jìn)行描述［11］。并記錄菌落在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度。

整體顯微形態(tài)觀察：

將在CLA或SNA平板培養(yǎng)好的菌體置于10倍或20倍目鏡下，觀察菌株特征：看是否有小孢子形成，小孢子的形成方式，小孢子是否鏈生等特點(diǎn)。觀察在PDA、SNA培養(yǎng)基上，及CLA平板中的康乃馨葉片上是否有分生孢子座形成，如果有，記錄其顏色。同時(shí)要注意觀察產(chǎn)孢細(xì)胞或瓶梗的特點(diǎn)。

顯微形態(tài)觀察：

用滅菌的挑針在CLA、SNA、WA平板上挑取少量培養(yǎng)物，置于載玻片上的水滴中，制成臨時(shí)玻片，然后在40倍目鏡下觀察菌體的形態(tài)特點(diǎn)，主要是大、小孢子，厚垣孢子及子實(shí)體形態(tài)。包括大孢子的整體形態(tài)、大小、分隔數(shù)、基孢和頂孢形態(tài)；產(chǎn)孢細(xì)胞及產(chǎn)孢梗的形態(tài)；小孢子和厚垣孢子的形態(tài)大小等。

最后參考Leslie、Nelson、Booth的分類系統(tǒng)，對(duì)分離到的鐮孢菌菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定［12～14］。

1.2.3 致病性測(cè)定

按照柯赫氏法則，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站試驗(yàn)基地進(jìn)行玉米穗腐病的致病性回接試驗(yàn)。

供試玉米植株的培育：于2011年春，將供試玉米種子播種于連續(xù)5年內(nèi)未種植玉米的地塊內(nèi)，備用。

玉米基質(zhì)的制備：將預(yù)先準(zhǔn)備好的玉米用自來水泡軟，與適量牙簽混勻，裝入可進(jìn)行高壓滅菌的聚丙烯食用菌菌袋內(nèi)，裝入量為袋容量的2／3，用線繩封口后，經(jīng)高壓蒸汽滅菌30min后，備用。

菌種的制備：將單孢分離物接種于PDA平板上，25℃培養(yǎng)5d后，自菌落邊緣打取4mm大的菌碟，接入Armstrong培養(yǎng)液中，震蕩培養(yǎng)4～5 d，用雙層紗布濾掉菌絲，將濾液離心后收集孢子，再用無菌水配成濃度為1×106個(gè)·mL－1的孢子懸浮液，然后將該孢子懸浮液接種到裝有無菌玉米培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，室溫下培養(yǎng)一周后，作為菌種進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)的種子。然后將培養(yǎng)好的種子接種到已制備好的玉米基質(zhì)內(nèi)，于室溫下發(fā)酵10天后，備用。

致病性回接與病原物的再分離：于玉米乳熟期，選取健壯玉米苗上的雌穗為接種對(duì)象，從以上各菌種發(fā)酵的產(chǎn)物內(nèi)，分別挑選長(zhǎng)滿各種菌的牙簽，將其單獨(dú)或以兩兩組合的方法，插入供試的玉米雌穗組織內(nèi)。然后照常管理，于收獲前10天調(diào)查發(fā)病情況，取發(fā)病明顯的病穗，按照1.2.1的方法對(duì)其上的病原菌進(jìn)行重新分離、純化，并經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后，看是否與原接種菌種相同。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 病樣分離、純化結(jié)果

由表1可看出，從山西省兩縣市采集的20余份玉米穗腐病樣品中共分離到53株鐮孢菌，其中28株為輪枝鐮孢菌，分離頻率為46.7%，15株為禾谷鐮孢菌，分類頻率為24.9%，10株半裸鐮孢菌，分離頻率為16.7%。

2.2 病原菌形態(tài)特點(diǎn)

2.2.1 輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioides）（圖1）

表1 玉米穗腐病鐮孢菌的分離結(jié)果Table 1 Isolation result of Fusarium species from maize ear rot

圖1 輪枝鐮孢菌Fig.1 F.verticillioides（×400）注：A.小型分生孢子；B.單瓶梗產(chǎn)孢；C.大型分生孢子；D.串狀著生string，假頭狀著生Note：A：microconidium；B：monophialidespore；C：macroconidium；D：microconidium，psudocapitata

輪枝鐮孢蓖：氣生菌絲羊毛狀至粉狀，粉色至紫色，后產(chǎn)生深紫色色素，基物表面及基物為暗紫色。在PDA平板上于25℃培養(yǎng)4d后，菌落直徑為3.5～4.6cm。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，瓶形，分枝或不分枝。小型分生孢子多，呈鏈狀，分生孢子鏈較長(zhǎng)，一般都大于50μm，有時(shí)聚集形成假頭狀。小孢子一端平截，為典型的棒槌形，沒有或有1分隔，量度為4.1～8.2μm×1.7～3.9μm。菌體培養(yǎng)后期可產(chǎn)生桔黃色分生孢子座。大型分生孢子細(xì)長(zhǎng)，較直，孢子的背腹兩側(cè)近似平行，兩端微收縮。頂細(xì)胞為漸細(xì)的錐形，略彎曲，基細(xì)胞為不明顯的足跟狀。大孢子壁較薄，分隔明顯，一般為3～5個(gè)分隔。量度為24.3～41.4μm×3.7～4.9μm。

2.2.2 禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）（圖2）

禾谷鐮孢菌：在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落生長(zhǎng)初期，呈放射狀。氣生菌絲呈羊毛狀旺盛生長(zhǎng)，白色至紫紅色，菌落中央常呈淺駝色至黃褐色，菌落背面為紫紅色。在25℃下培養(yǎng)4d后，菌落直徑為2.6～3.3cm。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗。小型分生孢子缺乏。在SNA或CLA上產(chǎn)生桔黃色分生孢子座。大型分生孢子較直或鐮刀形，頂細(xì)胞略彎曲，漸尖，短喙?fàn)?，基部足跟明顯。一般3～6分隔，多為5隔，量度為39.13～78.73μm×3.99～6.37 μm。在培養(yǎng)后期大孢子數(shù)量明顯減少。厚垣孢子聚生或串生，間生或頂生，球形或近球形，淺褐色。

圖2 禾谷鐮孢菌Fig.2 F.graminearum （×400）注：A.大型分生孢子；B.單瓶梗產(chǎn)孢；C.厚垣孢子 ，圖3同。Note：A.macroconidium；B.monophialidespore；C.chlamydosporem，The same as in Fig.3.

2.2.3 半裸鐮孢菌（Fusarium semitectum）（圖3）

半裸鐮孢菌：在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)4d后，菌落直徑為4.2～5.6cm。氣生菌絲羊毛狀或羊絨狀，初期白色至淡粉紅，菌落背面粉色，后期菌落變?yōu)闇\駝色至褐色，基物表面茶褐色，菌落背面深褐色。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗、復(fù)瓶梗和多芽產(chǎn)孢共存。氣生菌絲上產(chǎn)生的大小孢子之間沒有明顯的界限，存在大量的中型分生孢子。分生孢子多數(shù)為倒卵形或紡錘形，稍彎或直。分生孢子座上產(chǎn)生的孢子鐮狀，稍彎，頂細(xì)胞楔形，基細(xì)胞突起，足跟有或無，多為3～5個(gè)分隔，量度為28.72～39.99μm×4.61～5.93μm。厚垣孢子極少，球形，單頂生或串生于菌絲中間，褐色。

2.3 分離物致病性試驗(yàn)結(jié)果

致病性測(cè)定結(jié)果表明（表2），與對(duì)照相比，除接種半裸鐮孢菌的雌穗沒有表現(xiàn)明顯的癥狀外，其余接種方式的雌穗都表現(xiàn)出了不同程度的穗腐病癥狀。在單一菌種接種試驗(yàn)中，接種禾谷鐮孢菌的雌穗發(fā)病最重，發(fā)病率為84%，田間癥狀表現(xiàn)為，被害果穗頂部或中部明顯變色，局部或大片果穗腐爛，病粒皺縮，并出現(xiàn)粉紅色霉層。接種輪枝鐮孢菌的雌穗發(fā)病相對(duì)較輕，發(fā)病率為70%，多數(shù)發(fā)病雌穗表現(xiàn)為個(gè)別或局部籽粒變色、腐爛，并出現(xiàn)乳白色、粉色霉層；在3種菌的兩兩隨機(jī)組合接種試驗(yàn)中，禾谷鐮孢菌與輪枝鐮孢菌組合接種的雌穗發(fā)病最重，其發(fā)病率明顯高于單獨(dú)接種輪枝鐮孢菌與其他兩種組合的接種試驗(yàn)，為86%。田間癥狀表現(xiàn)為，多數(shù)果穗大片或整個(gè)腐爛，果穗病部苞葉還常被密集的菌絲貫穿，黏在一起貼在果穗上很難剝離。

圖3 半裸鐮孢菌Fig.3 F.semitectum（×400）

對(duì)接種后再次發(fā)病的植株進(jìn)行的病原菌分離純化結(jié)果表明（表2），單獨(dú)接種輪枝鐮孢菌的病穗上再分離得到的病菌與原接種菌株相同，仍為輪枝鐮孢菌。在單獨(dú)接種禾谷鐮孢菌的病穗上不僅可以分離到禾谷鐮孢菌，而且還可以分離到輪枝鐮孢菌；在3種菌兩兩組合的接種試驗(yàn)中，輪枝鐮孢菌與半裸鐮孢菌混合接種的病穗上，及輪枝鐮孢菌與禾谷鐮孢菌混合接種的病穗上，再分離得到的菌株也與原菌株相同。而在禾谷鐮孢菌與半裸鐮孢菌混合接種的病穗上，除分離到與原菌株相同的菌株外，還分離到了輪枝鐮孢菌?？梢?，自接種輪枝鐮孢菌的病穗上再分離只能得到與原菌種一致的菌種，而接種禾谷鐮孢菌的病穗上除可以分離到原接種的菌種，即禾谷鐮孢菌外，還可以分離到未接種的輪枝鐮孢菌。

表2 鐮孢菌在玉米上的致病性測(cè)定Table 2 Virulence test of Fusarium isolates to cucumber

由此可見，原接種菌種中的禾谷鐮孢菌與輪枝鐮孢菌均為山西省玉米穗腐病的致病菌，禾谷鐮孢菌侵染的植株也會(huì)受到輪枝鐮孢菌的侵染，但輪枝鐮孢菌侵染的植株不一定會(huì)受到禾谷鐮孢菌的侵染，而且兩種菌復(fù)合侵染時(shí)，玉米穗腐病發(fā)病最嚴(yán)重。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)玉米穗腐病致病菌的分離、純化、鑒定及致病性回接試驗(yàn)，確定了山西省晉城市和太谷縣玉米穗腐病的病原鐮孢菌為輪枝鐮孢菌和禾谷鐮孢菌，其中輪枝鐮孢菌為優(yōu)勢(shì)種，且兩種菌復(fù)合侵染要比單獨(dú)侵染對(duì)玉米造成的為害更嚴(yán)重。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究山西省玉米穗腐病的流行規(guī)律，發(fā)病機(jī)制、抗病育種等方面提供了可靠的理論依據(jù)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，引起玉米穗腐病的病原菌有二十多種，但各地報(bào)道的優(yōu)勢(shì)種不完全一致。國(guó)內(nèi)多數(shù)研究表明，輪枝鐮刀菌為吉林、陜西、河北各玉米產(chǎn)區(qū)玉米穗腐病的優(yōu)勢(shì)種群［15～17］，與本研究結(jié)果一致。而云南玉溪地區(qū)則以禾谷鐮刀菌F.graminearum為優(yōu)勢(shì)種［18］。本研究結(jié)果表明，雖然輪枝鐮孢菌的分離頻率最高，為引起該病的優(yōu)勢(shì)病原菌種群，但是，在接種禾谷鐮孢菌的病穗上同時(shí)還可以分離到未接種的輪枝鐮孢菌，而接種輪枝鐮孢菌的病穗上分離不到禾谷鐮孢菌，且兩種菌復(fù)合侵染比單獨(dú)一種菌侵染發(fā)病更嚴(yán)重?？梢姡坦如犳呔那秩居兄谳喼︾犳呔那秩?，加重了該病的發(fā)生，其原因還有待于進(jìn)一步探討。

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