不同能量蛋白水平對綿羊睪丸生精細胞凋亡及相關基因表達的影響

徐晶晶，張春香，任有蛇，岳文斌

（山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷030801）

細胞凋亡（apoptosis）又稱程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD），是由基因主導的細胞自主性消亡過程。目前已經(jīng)證實，睪丸生殖細胞的凋亡與其他細胞的凋亡機制相似，是由多基因參與的復雜過程。Bcl－2家族在細胞凋亡調控中有重要作用，是影響細胞凋亡的關鍵因素之一。Bcl－2和Bax分別是Bcl－2家族中最有代表性的抑制凋亡和促進凋亡的基因。并且Bax是Bcl－2活性的主要調控因子［1］。研究發(fā)現(xiàn)外源營養(yǎng)物質可以調控哺乳動物的生殖細胞發(fā)育，并且有大量證據(jù)證明不同日糧蛋白水平對動物的生長性能、繁殖性能、精液品質是有影響的［2～6］。本試驗利用能量和蛋白質水平同步變化的日糧飼喂綿羔羊，探討日糧中不同能量蛋白水平對綿羊生精細胞凋亡的影響以及Bcl－2和Bax在此過程中的作用，旨在為通過營養(yǎng)調控手段提高綿羊生殖機能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

在山西萬榮昌肉羊養(yǎng)殖專業(yè)合作社選擇18只健康狀況良好、體重相似的杜泊×小尾寒羊（杜×小）雜種未去勢公羔。

1.2 試驗設計及日糧配方

在10天的適應期后，將18只羔羊隨機分配到飼喂能量蛋白水平不同的3組中：100%自由采食組、65%采食組和35%采食組。日糧組成符合NRC標準（2007）。試驗基礎日糧配方及其營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗基礎日糧配方及其營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient level of basis diet in this study

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗于2010年6月～2010年8月在山西萬榮昌肉羊養(yǎng)殖專業(yè)合作社進行，篩選出的羔羊在試驗開始之前進行驅蟲處理，并將其單獨飼喂于配有料槽和水源的3m2的欄中。每天8∶00飼喂一次，自由飲水。每日晨飼前清除料槽內剩料并稱重，保證自由采食組剩料約為飼喂量的10%，并根據(jù)前一天自由采食組的采食量計算限飼組每天的飼喂量，每天單獨采集飼料和剩料樣品（總量的10%采樣）保存，然后將這些樣品按照每只羊混合為總樣品，55℃干燥至少72h，經(jīng)過1mm孔篩粉碎，保存待測樣品。試驗羊每周稱重一次。各組飼養(yǎng)水平見表2。

表2 試驗各處理組的飼養(yǎng)水平Table 2 Feeding levels of the lambs in different treatments

1.4 屠宰取樣

當100%自由采食組公羔體重達到35kg，所有的羔羊禁食禁水16h后，頸靜脈放血屠宰，取睪丸組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 檢測方法

1.5.1 Bcl－2與Bax mRNA表達的檢測

以B2 M 為看家基因，引用Shi等［7］設計的Bcl－2和Bax引物信息，在北京六合華大基因科技股份有限公司重新合成。根據(jù)TaKaRa SYBR PrimeScript RT－kit試劑盒進行反轉錄及PCR擴增，并且逐步優(yōu)化反應體系，調整cDNA濃度和引物退火溫度，篩選出目的基因與內參基因引物的最佳反應條件。試驗得出Bcl－2和Bax引物的最適退火溫度分別是54℃和56℃。隨后進行所有樣品目的基因的檢測。數(shù)據(jù)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件進行各組之間的方差分析，分析結果進行顯著性檢驗，顯著性水平為0.05。

表3 Real－time PCR引物序列信息Table 3 Primer sequences for real－time PCR in this study

1.5.2 細胞凋亡檢測

試驗前玻片預先用多聚賴氨酸或APES進行處理，常規(guī)石蠟制片法制片，片厚5μm。用脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）檢測凋亡細胞。原位細胞凋亡檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，過程按使用說明書，即切片常規(guī)脫蠟至水，用3%H2O2室溫10min，蒸餾水洗5min×3次。標本片加0.01 mol·L－1TBS 1∶200新鮮稀釋Proteinase K濕盒中37℃消化1～15min，0.01mol·L－1TBS洗滌2min×3次。標本片加標記緩沖液，以保證切片濕潤。每張切片加緩沖液（TdT、DIG－d－UTP各1μL，標記緩沖液18μL），濕盒中37℃標記2h，TBS洗。滴加封閉液，室溫放置30min，甩掉封閉液，不洗。加抗體稀釋液1∶100稀釋的生物素化抗地高辛抗體，濕盒中37℃反應30min，TBS洗。加抗體稀釋液1∶100稀釋的SABC，濕盒中37℃反應30min，TBS洗。DAB顯色10～30min，水洗。蘇木精輕度復染，洗滌后脫水、透明、封片。光學顯微鏡下觀察，陽性染色定位于細胞核，呈棕黃色。每個個體在顯微鏡下取至少5個視野進行拍照，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析，得出每個視野中的陽性細胞數(shù)，對所得的數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析和差異顯著性檢驗。

2 試驗結果

2.1 不同能量蛋白水平對公羔睪丸中Bcl－2 mR NA表達的影響

Bcl－2基因的熒光定量擴增曲線如圖1所示。由圖2可以看出，不同能量蛋白水平組的公羊睪丸中，Bcl－2mRNA在65%采食組的表達量最低，在35%采食組中的表達量最高。35%采食組中的Bcl－2mRNA 表達量顯著高于65%采食組和100%自由采食組（P＜0.05），雖然100%自由采食組的表達量高于65%采食組，但兩者之間并無顯著差異（P＜0.05）。

圖1 Bcl－2和B2 M 的擴增動力學曲線（A）和溶解曲線（B）Fig.1 The PCR amplification plots（A）and dissociation curve（B）for Bcl－2and B2 M

圖2 各組羔羊睪丸中Bcl－2mRNA表達Fig.2 Bcl－2mRNA expressions in the lambs in different treatments

2.2 不同能量蛋白水平對公羔睪丸中Bax mR NA表達的影響

Bax基因的熒光定量擴增曲線如圖3所示。各處理組中Bax mRNA的表達如圖4所示，Bax mRNA在100%自由采食組表達量最低，在35%采食組中表達量最高。35%采食組中的Bax mRNA表達量顯著高于65%采食組和100%自由采食組（P＜0.05），雖然100%自由采食組的表達量低于65%采食組，但兩者之間并無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 Bax和B2 M 的擴增動力學曲線（A）和溶解曲線（B）Fig.3 The PCR amplification plots（A）and dissociation curve（B）for Baxand B2 M

圖4 各組羔羊睪丸中Bax mRNA表達Fig.4 Bax mRNA expressions in the lambs in different treatments

2.3 不同能量蛋白水平對公羔睪丸生精細胞凋的影響亡

由圖5可以看出，35%采食組羔羊睪丸中的凋亡細胞數(shù)量最多，100%自由采食組中凋亡細胞數(shù)量最少。35%采食組中的凋亡細胞數(shù)量顯著高于65%采食組和100%采食組（P＜0.05）。雖然100%自由采食組的凋亡數(shù)量低于65%采食組，但兩者之間并無顯著差異（P＞0.05）。

從TUNEL結果（圖6）可以看出，35%采食組細胞凋亡發(fā)生在精子產(chǎn)生的各個階段，曲細精管中未見成熟精子。而65%采食組和100%自由采食組凋亡的細胞主要發(fā)生在精原細胞和初級精母細胞中，曲細精管中能清晰看到成熟的精子，且隨著能量蛋白增加，精子數(shù)量有增加趨勢。

圖5 各組羔羊睪丸中的細胞凋亡數(shù)量Fig.5 Apoptotic cells in testis of the kids in different treatments

3 結論與討論

圖6 各處理組綿羊睪丸TUNEL結果Fig.6 TUNEL in testis of the kids in different treatments

研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中一些不利因素如營養(yǎng)缺乏可導致正常組織細胞凋亡。王全溪等［9］在飼料中添加不同含量的鋅，得出鋅含量過低或過高都能夠誘導雛番鴨免疫器官細胞凋亡。Fraker［10］曾用缺鋅飼料喂養(yǎng)小鼠，7周后發(fā)現(xiàn)胸腺萎縮殆盡。有證據(jù)證明不同日糧水平對動物的生長性能、繁殖性能和精 液 品 質 等 是 有 影 響 的［2～6］。景 煒 等［4］研 究 日 糧不同能量和蛋白水平對多浪羊繁殖性能及血液生化指標的影響，得出提高日糧能量水平對多浪羊春季發(fā)情率的提高有明顯效果。李靜［11］在研究日糧能量、蛋白水平對遼寧絨山羊種公羊精液品質和產(chǎn)絨性能的影響中得出日糧高蛋白水平可顯著提高采精量和精液密度，極顯著提高有效精子數(shù)和冷凍精液生產(chǎn)數(shù)量。劉洪波［12］研究日糧維生素E水平對羊精液品質的影響，得出日糧中添加適宜劑量的維生素E有助于提高綿、山羊采精量、精子密度和鮮精活率。根據(jù)以上證據(jù)推測日糧水平可以調控生精細胞的凋亡。本試驗驗證了這一推論。試驗結果表明，不同能量蛋白水平飼喂下，35%采食組綿羊生精細胞凋亡數(shù)量最多，表現(xiàn)在精子形成的各個階段，曲細精管中未見成熟精子。65%采食組和100%自由采食組綿羊生精細胞凋亡數(shù)量較少，凋亡主要發(fā)生在精原細胞和初級精母細胞中，曲細精管中成熟的精子清晰可見。因此不同能量蛋白水平是可以影響綿羊睪丸生精細胞的凋亡。

Kerr等［7］于1972年首先提出細胞凋亡，指有核細胞在特定條件下通過啟動內部機制，經(jīng)過一連串的細胞變性，最終發(fā)生死亡的過程。睪丸生殖細胞的凋亡與體細胞的增殖分化一樣受多種基因調控［8］。Bcl－2基因家族是細胞凋亡的重要調控基因。根據(jù)基因在細胞生長發(fā)育中所起的作用不同將Bcl－2家族的基因分為兩類：一類是細胞凋亡促進基因，一類是細胞凋亡抑制基因。1993年Oltvai等［13］首先發(fā)現(xiàn)Bax基因，它是Bcl－2家族的新成員，編碼的Bax蛋白是重要的促細胞凋亡因子，能對抗Bcl－2的生物學活性，過量表達可誘導細胞凋亡。一般認為Bax主要誘導凋亡，而Bcl－2則抑制凋亡，二者是互為相關調節(jié)基因［14］。兩者表達水平間的平衡決定著細胞的生死存亡［15］。近年來的研究提示，Bcl－2和Bax這兩種基因均參與了生精細胞凋亡的過程。

為了探討日糧不同能量蛋白水平對生精細胞凋亡的影響，本試驗選取了Bcl－2，Bax作為凋亡的指標。Bax作為細胞凋亡的促進基因，其表達量隨著日糧能量蛋白水平下調而增加，說明日糧能量蛋白水平越低細胞凋亡數(shù)量越多，這與TUNEL的結果是相吻合的。而Bcl－2作為細胞凋亡抑制基因，低能量蛋白水平下表達量增加，可能原因是日糧能量蛋白缺乏，導致精子發(fā)生過程中生精細胞大量凋亡，從而致使Bcl－2過量表達來抑制細胞凋亡。這樣的結果驗證了Vandaele等［16］得出的結論：Bcl－2的表達量并不能作為細胞凋亡的標志。因此，不同能量蛋白水平可以影響綿羊睪丸生精細胞凋亡，而Bcl－2和Bax參與了凋亡調控過程。

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