HPLC法測(cè)定人參養(yǎng)榮丸中人參皂苷Rb1的含量

麥艷珍,程 怡*,張素方，余秋強(qiáng)，趙菊香，鄧妙麗

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；2.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 湛江 524000)

人參養(yǎng)榮湯出自《三因極一病證方論》，由人參、熟地黃、當(dāng)歸、甘草、白術(shù)等14味中藥組方而成，具有益氣補(bǔ)血、健脾固腎、養(yǎng)心安神的功效?，F(xiàn)代醫(yī)藥工作者根據(jù)湯劑處方改良生產(chǎn)工藝，制備成丸劑。《中國藥典》[1]2010版一部收載人參養(yǎng)榮丸,并對(duì)橙皮苷進(jìn)行含量控制，制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。由于人參是本處方的君藥之一,其有效成分人參皂苷Rb1經(jīng)現(xiàn)代藥理研究[2-3]表明對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及在抗腫瘤方面都具有改善調(diào)節(jié)作用，因此本試驗(yàn)建立對(duì)方中人參皂苷Rb1的HPLC含量測(cè)定方法,完善本制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

戴安高效液相色譜儀(P680 HPLC Pump,ASI-100 Automated Sample Injector,PDA-100 Photodiode Array Detector,AT-330 Column Heater)，人參養(yǎng)榮丸為市售品(北京同仁堂股份有限公司，規(guī)格:9 g/丸)，人參養(yǎng)榮丸陰性樣品由本實(shí)驗(yàn)室按處方組成及工藝制成缺紅參的樣品(中藥材均由康美藥業(yè)股份有限公司提供)，人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào)：110704-200318)，購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純；水為去離子水；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(30∶70)，流速：1.0 mL/min；柱溫35 ℃，檢測(cè)波長203 nm，進(jìn)樣量10 μL；理論塔板數(shù)按人參皂苷Rb1計(jì)算不低于3 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rb1對(duì)照品3.50 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含人參皂苷Rb1 0.35 mg的人參皂苷Rb1溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品剪碎成小塊，精密稱定5.0 g，加入硅藻土1.5 g，研勻，置索氏提取器中，加甲醇60 mL，加熱回流提取至提取液近無色，提取液回收甲醇至干，殘?jiān)铀?0 mL，用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 mL，棄去三氯甲烷液，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次30 mL，再用正丁醇飽和的水洗至中性，回收正丁醇至干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至離心管，離心，過膜，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取缺人參的自制樣品，照2.3項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn) 按上述色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL進(jìn)樣檢測(cè)，得色譜圖(見圖1)。結(jié)果表明處方中其他成分不干擾人參皂苷Rb1的測(cè)定。

圖1 人參養(yǎng)榮丸HPLC專屬性色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察 在上述色譜條件下，依次精密吸取2. 1項(xiàng)下對(duì)照溶液2.0、6.0、10.0、14.0、18.0、22.0 μL，分別進(jìn)樣。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(mAU×min)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性回歸方程為Y=4.182 6X-1.208 8(r=0.999 5),結(jié)果表明人參皂苷Rb1在0.70～7.70 μg范圍內(nèi)，其峰面積與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定峰面積，連續(xù)測(cè)定6次。測(cè)定峰面積，計(jì)算平均值為13.028，RSD=1.17%(n=6)，結(jié)果表明精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)0010012)，在24 h內(nèi)分別每4h進(jìn)樣1次，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均值為14.242，RSD=0.92%(n=6)，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的樣品(批號(hào)0010012)，取樣6分，按2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均值為14.238，RSD=2.13%(n=6)，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)0010012)已知含量的樣品5 g，各6分，精密稱定，每分加1.5 g硅藻土，研勻，分別置索氏提取器中，精密加入甲醇60 mL，回流提取至無色，提取液回收甲醇至干，殘?jiān)盟芙?，分別精密加入相當(dāng)量的人參皂苷Rb1對(duì)照品，然后按2.3供試品溶液的制備項(xiàng)下自“用三氯甲烷振搖提取3次”起，繼續(xù)操作至供試品溶液制備完畢。進(jìn)樣量為10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果平均回收率為98.87%,RSD=0.86%(n=6)。結(jié)果表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度。

2.11 含量測(cè)定 制備3批樣品的供試品溶液，吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果0010012、0010061、0010256的人參皂苷Rb1含量分別為1.386、1.368、1.341。RSD分別為1.21%、0.98%、1.23%。

3 討論

本處方藥味較多，成分復(fù)雜。筆者曾采用不同的方法制備供試品溶液，結(jié)果HPLC色譜圖顯示對(duì)目標(biāo)峰的干擾太大，分離效果不好。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4-6]，進(jìn)行多次反復(fù)試驗(yàn)，證明人參皂苷Rb1在堿性條件下穩(wěn)定，且樣品經(jīng)堿性溶液洗滌后，能有效除去大部分酸性物質(zhì)，排除HPLC檢測(cè)的干擾組分，故確定采用本試驗(yàn)中的供試品溶液制備方法。

[1]中華人民共和國藥典委員會(huì).中國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:438-439.

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