HPLC法測(cè)定腰腿痛寧中柚皮苷的含量

聞 輝，李曉春，王 沛,李雪婷,趙文海

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117)

腰腿痛寧是長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院應(yīng)用多年的協(xié)定處方，由骨碎補(bǔ)、鹿角霜、熟地黃、北黃芪、狗脊、當(dāng)歸等10幾味名貴中藥組成，具有補(bǔ)腎強(qiáng)筋壯骨之功效，臨床療效確切。為將其由醫(yī)院制劑室的協(xié)定處方開(kāi)發(fā)成為新藥面世，特制定如下控制該制劑質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)及方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀Waters 600，美國(guó)沃特世公司；超聲波清洗儀KQ-DB-3200，昆山市儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-202，上海申花生物科技公司；SHB-3型循環(huán)多用真空泵，鄭州市杜甫儀器有限公司；AL-204型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑 柚皮苷對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110722-200611；腰腿痛寧制劑，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供(批號(hào)分別為110301、110303、110401、110402、110403、110404)；陰性對(duì)照品，由本研究室自制；甲醇、色譜純(西隴化工股份有限公司)，水(杭州娃哈哈純凈水)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜分析 色譜柱：Autanlit C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-磷酸溶液(0.10 mol/L)20∶80；流速：1.0 mL/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫：22 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 樣品溶液的制備 取腰腿痛寧制劑約2 g，精密稱定，加甲醇50 mL，加熱回流4 h,放冷，濾過(guò)，濾液置于50 mL容量瓶中，用少量甲醇分次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中,加甲醇定容至刻度[1]，搖勻，用0.45 μm 微膜濾過(guò)，取濾液，作為制劑樣品供試品[2]。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)80 ℃干燥至恒重的柚皮苷對(duì)照品4.300 mg，置于100 mL容量瓶中，用色譜純甲醇溶解，并加至刻線，搖勻,即得(每1 mL中含柚皮苷對(duì)照品0.043 0 mg)。

2.4 陰性對(duì)照品溶液制備 按處方比例稱取除骨碎補(bǔ)外的其他藥物，按腰腿痛寧制劑制法制成的陰性對(duì)照品制劑，再按2.2項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照品。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品溶液、陰性對(duì)照品溶液按2.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行分析,理論塔板數(shù)不低于4 000，陰性對(duì)照對(duì)供試品測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取2.3項(xiàng)下柚皮苷對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，分別精密吸取20 μL進(jìn)樣。 以柚皮苷對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，柚皮苷峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為：Y=1 627 809.246 5X+161 87.282 5，r=0.999 8(n=6)。

結(jié)果表明，柚皮苷在0.086 0～0.532 1 μg之間與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.3項(xiàng)下的柚皮苷對(duì)照品溶液6分，每分4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，分別精密吸取20 μL進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰面積。計(jì)算得柚皮苷對(duì)照品的平均峰面積為577 287.912，RSD值為0.064 9%，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)有良好的精密度。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試樣品適量,精密稱定，依照樣品溶液制備方法制備制劑樣品溶液，室溫(25 ℃)下放置0、2、4、8、16 h時(shí)，分別測(cè)定各樣品的峰面積，結(jié)果所取供試樣品平均峰面積為677 217.293，RSD值為1.98%。峰面積無(wú)明顯變化，說(shuō)明此時(shí)間內(nèi)，供試樣品溶液化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.9 樣品測(cè)定 分別取腰腿痛寧成品6批(110301、110303、110401、110402、110403、110404)適量，按2.2項(xiàng)下操作制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)行分析，根據(jù)外標(biāo)法測(cè)定面積并計(jì)算柚皮苷含量，見(jiàn)表1。結(jié)果符合所擬定的含量波動(dòng)范圍(95%～105%)。

a.標(biāo)準(zhǔn)品液相圖譜

b.樣品液相圖譜

c.陰性對(duì)照液相圖譜

表1 腰腿痛寧中的柚皮苷含量(n=5)

2.10 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，分別取已知含量的樣品5分，精密稱定，按2.2項(xiàng)下操作制備樣品溶液，置于50 mL容量瓶中，再分別精密加入2.3項(xiàng)下的對(duì)照品溶液4 mL，甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微膜濾過(guò)，取濾液，分別吸取20 μL進(jìn)樣測(cè)定色譜峰峰面積。結(jié)果加樣平均回收率為100.02%，RSD值為0.158 3%。

3 討論

3.1 控制指標(biāo)的選擇 骨碎補(bǔ)為方中主藥，是骨傷科常用中藥，具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨、續(xù)傷止痛功效。骨碎補(bǔ)主要含有二氫黃酮、黃烷-3-醇及其衍生物、二聚物和三聚物類、三萜、酚酸、原兒茶酸等多種化學(xué)成分，其中二氫黃酮(以柚皮苷為代表)是其主要活性成分，有促進(jìn)骨折愈合、防治骨質(zhì)疏松、抗氧化、調(diào)血脂、抗炎、鎮(zhèn)痛等生物活性[2-4]。所以選擇控制骨碎補(bǔ)中的柚皮苷含量為該中藥復(fù)方的質(zhì)量指標(biāo)。

3.2 色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法采用的色譜條件是根據(jù)上述樣品的溶解性，并參考相應(yīng)的文獻(xiàn)[5-9],經(jīng)逐步實(shí)驗(yàn)考察，同時(shí)考慮到今后的規(guī)模化生產(chǎn)狀況成本而定。

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