金水六君煎對亞急性衰老模型小鼠氧化應(yīng)激的影響

彭 圓,田代志,程 靜,張麗君,王 平*

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥復(fù)方省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430065)

真皮組織學(xué)改變是皮膚衰老最顯著特征之一。皮膚衰老與氧化應(yīng)激的關(guān)系已為許多研究所證實(shí)。氧化/抗氧化失衡是皮膚衰老的重要發(fā)生機(jī)制。氧化應(yīng)激可直接損傷皮膚組織細(xì)胞,啟動真皮纖維降解或變性,加劇皮膚老化進(jìn)程[1]。本課題組在中醫(yī)皮膚衰老理論指導(dǎo)下，采取D-半乳糖皮下注射建立亞急性衰老模型,觀察補(bǔ)腎化痰方金水六君煎對衰老模型小鼠氧化應(yīng)激的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 昆明種2月齡清潔級小鼠30只，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供。動物質(zhì)量合格證號：NO00004136，NO00004137。

1.2 主要藥品與試劑 D-半乳糖(張家港市華昌藥業(yè)有限公司)，臨用前溶于超純水,現(xiàn)配為10%濃度；金水六君煎各組分中藥(熟地黃30 g，當(dāng)歸12 g，半夏12 g，陳皮10 g，茯苓12 g，炙甘草6 g等)購自湖北中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂藥房。按原著換算，依照人單位體質(zhì)量生藥量求得小鼠單位體質(zhì)量生藥量，并擴(kuò)大2倍，常法濃縮成0.70 g/mL(0.70 g生藥/mL)的浸膏，避光冷藏備用。

羥脯氨酸試劑盒(Hyp)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器 AL104型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；721型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；FSH-Ⅱ型可調(diào)高速電動勻漿機(jī)(江蘇省金壇市恒豐儀器廠)；TGL-16G-A型低溫離心機(jī)(AnKe)；光學(xué)顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 亞急性衰老模型的制作及給藥 根據(jù)性別和體質(zhì)量隨機(jī)分組，每組10只，雌雄分籠，共分3組，即空白組、模型組、金水六君煎組(以下簡稱金組)。適應(yīng)飼養(yǎng)5 d后，參照文獻(xiàn)[2]采用每天頸背部皮下注射10%D-半乳糖1 000 mg/kg造模，共6周?？瞻捉M每天頸背部皮下注射超純水(0.10 mL/10 g)，模型組、空白組每天按0.20 mL/10 g體積灌胃給予超純水，金組按濃度0.70 g/mL灌胃等體積的藥物，連續(xù)6周。

2.2 生化指標(biāo)測定 小鼠于第42天給藥處理后，行兩肩胛至兩髂骨之間的備皮。次日行眼眶取血，于3 500 r/min離心5 min，取上層血清，參照試劑盒說明(下同)用于SOD活性與HYP含量的測定。

同時在冰上取背部皮膚組織塊和肺組織制成10%勻漿，檢測SOD活性。另取背部余皮0.1 g左右，檢測皮膚組織HYP含量。

2.3 皮膚形態(tài)學(xué)觀察 10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡(10×10)下觀察。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠生化指標(biāo)變化比較 見表1，表2。

表1 各組小鼠血清SOD、皮膚SOD、肺SOD活性比較±s,n=10)

表2 各組小鼠血清、皮膚羥脯氨酸含量比較±s,n=10)

3.2 皮膚形態(tài)學(xué)觀察 空白組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮與真皮界線清晰，表皮規(guī)則，真皮層厚，纖維排列致密、數(shù)量多；皮下脂肪細(xì)胞稀少；毛囊、皮脂腺清晰可見。與空白組比較，模型組小鼠皮膚顯著變薄，真皮纖維排列疏松、數(shù)量減少；皮下脂肪細(xì)胞填充明顯增多，達(dá)5～7層。與模型組比較，金組小鼠皮膚顯著增厚，真皮纖維排列密集、數(shù)量增多，皮下脂肪細(xì)胞填充明顯減少，0～2層。

4 討論

皮膚衰老的發(fā)生機(jī)制尚未完全明了,氧化/抗氧化失衡所引起的氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是皮膚衰老主要發(fā)病機(jī)制之一。氧化應(yīng)激是指由于氧化劑增多和(或)抗氧化劑減少導(dǎo)致的氧化/抗氧化失衡狀態(tài)。正常情況下機(jī)體存在抗氧化物系統(tǒng),使得體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡，不會產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激損傷。在抗氧化物系統(tǒng)中SOD具有較強(qiáng)的抗氧化作用,是體內(nèi)催化超氧陰離子為過氧化氫的關(guān)鍵酶，其含量的高低反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。羥脯氨酸(HYP)是膠原纖維和膠原蛋白中的一種主要而又相對恒定的非必需氨基酸,其含量的測定已成為檢測機(jī)體膠原代謝的重要指標(biāo)，也是衡量皮膚衰老的指標(biāo)之一。

皮膚衰老屬中醫(yī)學(xué)“衰老”范疇，以本虛標(biāo)實(shí)為主要特征，本虛在于臟腑功能虛衰，標(biāo)實(shí)在于痰濁。一方面腎虛為主的臟腑功能失調(diào)可導(dǎo)致痰濁的產(chǎn)生，即因虛致實(shí)；另一方面，痰濁為患又可影響氣血津液的化生和運(yùn)行，致本虛更甚，即因?qū)嵍绿?，兩者互為因果，形成惡性循環(huán)。以補(bǔ)腎化痰治法遣方用藥，延緩皮膚老化，能做到標(biāo)本兼治。結(jié)合本課題組對化痰方藥改善肺系疾病的研究[3]成果及國內(nèi)學(xué)者[4-5]對金水六君煎的研究,本實(shí)驗(yàn)選用金水六君煎，觀察其對衰老模型小鼠皮膚氧化應(yīng)激的影響。

本實(shí)驗(yàn)顯示，D-半乳糖連續(xù)6周皮下注射能建立亞急性衰老模型，模型鼠不僅出現(xiàn)血清抗氧化功能的下降，而且皮膚組織SOD活性、血清與皮膚組織HYP含量均明顯下降、皮膚顯著變薄，真皮纖維排列疏松、數(shù)量減少。提示存在嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷。這與Tian等[6]的研究一致。金水六君煎組與模型組比較有顯著差異,提示金水六君煎能明顯改善衰老模型小鼠氧化/抗氧化失衡狀態(tài)。此外，應(yīng)用金水六君煎組后能明顯增強(qiáng)模型鼠肺SOD活性，從而說明減輕肺組織的氧化損傷，可能有助于增強(qiáng)模型鼠肺行水布津，實(shí)現(xiàn)濡養(yǎng)滋潤皮毛，延緩皮膚的衰老。

綜上所述，通過補(bǔ)腎化痰，補(bǔ)充陰液之本，使水能潤金，肺之氣陰不受其損，改善肺氣的宣發(fā)肅降，肅潔貯痰之器，恢復(fù)肺臟的行水布津功能，有助于減輕衰老組織的氧化應(yīng)激損傷，糾正氧化/抗氧化失衡狀態(tài),這可能是金水六君煎改善衰老模型小鼠皮膚老化的機(jī)制之一。

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