新發(fā)現(xiàn)的蒙古族ABCA1M233V基因和R219K基因多態(tài)性

袁托亞, 劉曉宇, 王悅喜

?

新發(fā)現(xiàn)的蒙古族ABCA1M233V基因和R219K基因多態(tài)性

袁托亞, 劉曉宇*, 王悅喜

（內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科, 呼和浩特 010050）

探討ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1基因（ABCA1）M233V和R219K多態(tài)性在內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群中的分布及其與血脂和冠心病的關(guān)系。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測(cè)115例蒙古族冠心病患者和對(duì)照組ABCA1基因相應(yīng)片段的多態(tài)性。內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群中ABCA1基因M233V多態(tài)性位點(diǎn)存在MM, MV和VV三種基因型, 其在冠心病患者和對(duì)照組人群的基因多態(tài)性分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。MM組和MV+VV組總膽固醇（TC）, 甘油三酯（TG）, 高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）比較, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。對(duì)照組KK基因型的頻率顯著高于CHD組（＜0.05)。KK基因型的HDL-C水平顯著高于RR型（＜0.05）, KK型TG水平明顯低于RR型, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05)。內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群中存在新發(fā)現(xiàn)的ABCA1基因M233V多態(tài)性, ABCAl基因R219K多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群冠心病的遺傳易感性相關(guān), KK基因型產(chǎn)生有益的臨床血脂譜, 可能是冠心病患者的低危遺傳標(biāo)記。

冠心病; 三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1; 多態(tài)性; 蒙古族

國內(nèi)外均有研究表明, 三磷酸腺苷結(jié)合盒子轉(zhuǎn)運(yùn)體1 （ATP binding cassette transporter 1,ABCA1）功能障礙可促進(jìn)冠心病的發(fā)生發(fā)展。我們?cè)谥袊晒抛迦酥邪l(fā)現(xiàn)一個(gè)國內(nèi)外僅見一次報(bào)道的新單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)即M233V基因多態(tài)性位點(diǎn)的改變, 我們首次發(fā)現(xiàn)了VV型（GG型）基因型變異。本研究探討了中國蒙古族人ABCA1基因R219K和M233V變異位點(diǎn)及與血脂、冠心病的關(guān)系, 旨在為內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族冠心病的預(yù)防及治療提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

共觀察內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族115例, 均來自2008年12月～2010年10月內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院患者。冠心病組60例, 平均年齡（58.77±9.98）歲, 行冠狀動(dòng)脈造影確診（至少1支冠狀動(dòng)脈直徑狹窄≥50%） 30例, 經(jīng)臨床癥狀結(jié)合心電圖、超聲心動(dòng)圖、平板運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)、心肌灌注ECT顯像及64排冠狀動(dòng)脈CT確診30例; 對(duì)照組55例, 平均年齡（55.10±11.8）歲, 經(jīng)詢問病史、體檢、實(shí)驗(yàn)室檢查（血、尿、糞便常規(guī), 血脂, 血糖, 肝、腎功能）、心電圖、胸片、心臟彩超、心肌灌注ECT顯像、64排冠狀動(dòng)脈CT、冠狀動(dòng)脈造影等檢查排除冠心病、嚴(yán)重肝腎功能不全。排除標(biāo)準(zhǔn): 風(fēng)濕性疾病、大動(dòng)脈炎、血液病、結(jié)核、腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全、腦血管疾病等。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平的檢測(cè) 所有化驗(yàn)檢查均采用次日清晨空腹采取肘靜脈血3ml, 分離血清測(cè)定血脂水平, 甘油三酯（triglyceride, TG）、總膽固醇（total cholesterol, TC）以氧化酶法測(cè)定, 高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein- cholesterol, LDL-C）用PEG變構(gòu)酶法測(cè)定, 試劑均為L(zhǎng)eadman公司生產(chǎn)。儀器為日本OLYMPUS AU 600全自動(dòng)生化分析儀。

1.2.2 DNA提取 用EDTA抗凝真空采血管采集外周靜脈血3ml, 置于－80℃保存?zhèn)溆谩０凑昭?細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒的說明提取血液DNA（由TIANGEN公司提供）。

1.2.3 設(shè)計(jì)引物 設(shè)計(jì)PCR引物, R219K上游引物: 5￠-GTATTTTTGCTACCAGTTACATTTGACAA-3￠,下游引物: 5￠-GATTGGCTTCAGGATTGTTGGAA-3￠。M233V上游引物:5'GCAAGGCTACCAGTTACATT-3', 下游引物: 5'-GTCCAAGGAAAAGCCTCA-3￠, 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.2.4 ABCA1基因多態(tài)片段的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)在PTC-200型循環(huán)儀中進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系50μl, 包括: 2×Taq PCR MasterMix（由Tiangen公司提供）25μl, DNA 2.0μl, 上游和下游引物分別1.0μl（10μmol/L）, 滅菌超純水21μl。PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30 s, 53℃退火30s, 72℃延伸40s, 共25個(gè)循環(huán); 72℃終末延伸5 min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的酶切消化Ⅰ酶切反應(yīng)體系30μl, PCR產(chǎn)物10μl,Ⅰ內(nèi)切酶（由Fermantas公司提供）1.0μl, 10×NEB Buffer 2.0μl, 滅菌超純水18.0μl, 置于37℃酶切12h。取酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)并確定樣品基因型。DNA Marker為BioMarkerⅠ（100bp, 由BioFluk公司提供）。II酶切反應(yīng)體系20μl, PCR產(chǎn)物10μl, 限制性內(nèi)切酶II（由BioLab公司提供）0.6μl, 10×NEB Buffer 2.0μl, 滅菌超純水7.4μl。置于25℃恒溫水浴箱中18h, 2%瓊脂糖凝膠驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 冠心病組與對(duì)照組的一般資料和基因分布平衡檢驗(yàn)

兩組研究對(duì)象一般資料見表1。對(duì)冠心病組和對(duì)照組的基因型分布進(jìn)行了平衡檢驗(yàn), 結(jié)果表明, R219K基因型（冠心病組:2=0.023, df=1,＞0.05; 對(duì)照組:2=3.04, df=1,＞0.05）和M233V基因型（冠心病組:2=0.83, df=1,＞0.05; 對(duì)照組:2=1.17, df=1,＞0.05）的分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律, 具有群體代表性。

表1 冠心病組和對(duì)照組一般資料

HDL-C: 高密度脂蛋白膽固醇; LDL-C: 低密度脂蛋白膽固醇; TG: 甘油三酯; TC: 總膽固醇。與對(duì)照組比較,*＜0.05

2.2 R219K位點(diǎn)多態(tài)性分析

R219K 擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為177bp, 經(jīng)Ⅰ酶切后, K等位基因被切為3個(gè)可能的基因型（圖1）。RR型: 純合子GG（177 bp）; RK型: 雜合子GA（177 bp, 107 bp, 70bp）; KK 型: 純合子AA（107bp, 70bp）。表2結(jié)果表明, 冠心病組與對(duì)照組間基因型和等位基因頻率分布比較, 冠心病組KK型分布明顯低于對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）, 基因型KK個(gè)體顯著減少患冠心病的危險(xiǎn)[OR=0.411, 95%CI 0.17～0.99]。

圖1 R219K酶切(XagⅠ)產(chǎn)物

Figure 1Ⅰ digested products of R219K

M: 100bp DNA Marker; 1,4: RR基因型; 2: RK基因型; 3: KK基因型

表2 兩組ABCA1基因型和等位基因頻率分布

注: 與對(duì)照組比較,*＜0.05

2.3 M233V位點(diǎn)多態(tài)性分析

ABCA1基因第7號(hào)外顯子DNA序列中1092位上一個(gè)核苷酸由G→A的改變（A1092G）, 導(dǎo)致233位氨基酸由甲硫氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸（M233V）。ABCAl產(chǎn)物片段總長(zhǎng)度為240bp。經(jīng)特異性限制內(nèi)切酶消化之后, 這個(gè)240 bp片段可被切割成三個(gè)可能的基因型: VV（240 bp）, MV（240bp, 146bp, 94bp）, MM（146bp, 94bp）（圖2）。冠心病組發(fā)現(xiàn)18例A1092G位點(diǎn)的改變, 發(fā)生率為30%, 其中17例為MV型, 1例為VV型。對(duì)照組14例改變, 全部為MV型, 發(fā)生率為25.6%。兩組人群的基因多態(tài)性分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 M233V酶切(CviAⅡ)產(chǎn)物

Figure 2Ⅱ digested products of M233V

M: 100bp DNA Marker; 1: MV基因型; 2: MM基因型; 3: VV基因型

2.4 R219K和M233V各基因型血脂水平比較

M233V V等位基因攜帶者和非攜帶者間TC, TG, HDL-C, LDL-C比較, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。R219K ABCA1不同基因型之間血脂水平比較, KK型和RK型TG與RR型比較, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）, KK型HDL-C與RR型比較, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05; 表4）。

表3 ABCA1 M233V V等位基因攜帶者和非攜帶者血脂比較

注: HDL-C: 高密度脂蛋白膽固醇; LDL-C: 低密度脂蛋白膽固醇; TG: 甘油三酯; TC: 總膽固醇

表4 ABCA1 R219K三種基因型血脂比較

注: TC: 總膽固醇; TG: 甘油三酯; HDL-C: 高密度脂蛋白-膽固醇; LDL-C: 低密度脂蛋白-膽固醇。與RR基因型比較,*＜0.05

3 討 論

1999年人們闡明ABCA1基因變異與丹吉爾病、家族性HDL-C缺乏的發(fā)生密切相關(guān)。ABCA1基因?qū)儆贏TP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子基因超家族中的一個(gè)亞型, ABCA1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出, 是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的起始環(huán)節(jié), 機(jī)體清除組織細(xì)胞內(nèi)過多的膽固醇主要是通過膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)來實(shí)現(xiàn)的。如果ABCA1基因突變, 有可能使其編碼的氨基酸改變, 從而導(dǎo)致其功能發(fā)生改變, 使膽固醇外流障礙, 膽固醇和膽固醇脂在巨噬細(xì)胞內(nèi)積聚而成為泡沫細(xì)胞, 繼而浸潤(rùn)血管壁, 促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生發(fā)展。已有研究顯示, 用骨髓移植的方法使巨噬細(xì)胞過表達(dá), ABCA1可以明顯抑制動(dòng)脈粥樣硬化病變的進(jìn)程[1]。在動(dòng)脈壁, 增加ABCA1的表達(dá)可使巨噬細(xì)胞清除自身過多的膽固醇, 從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[2]。因此, ABCA1基因是調(diào)節(jié)膽固醇和磷脂代謝平衡的關(guān)鍵途徑, ABCA1與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

單核苷酸多態(tài)性在人群中的發(fā)生率差異很大, 不同類型和位置的ABCA1變異, 其表現(xiàn)各異, 即使是相同或距離較近的變異, 其意義也截然不同。有些變異（如同義突變）可能沒有或很少影響到ABCA1的功能, 與血漿HDL-C水平變化無明顯相關(guān)性, 如-565 C/T, 但其T等位基因可能增加亞臨床型心血管疾病的危險(xiǎn)性[3]。有一些變異使HDL-C增高[3-5], 具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用和減少冠心病的危險(xiǎn)性, 如R219K,C-105T,V771M和V825I; 有些變異使HDL-C水平下降, 增加冠心病的危險(xiǎn)性, 如E1172D和R1587K[5]。在啟動(dòng)區(qū)的核苷酸多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度相關(guān), 如-191C/-320C/-477T, G191C和A-1096G加重動(dòng)脈粥樣硬化, 而C17G減輕動(dòng)脈粥樣硬化, 這些變異不伴有血脂水平的改變。此外, V825I, I883M, E1172D單核苷酸多態(tài)性能使臨床事件增加及動(dòng)脈粥樣硬化加重[6]。

目前, 國內(nèi)外研究較多且較深入的單核苷酸多態(tài)性突變是R219K型ABCA1, 通過PCR-RFLP方法檢測(cè)內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族ABCAl R219K多態(tài)性, 證實(shí)了在內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群中存在ABCA1 R219K變異。冠心病組RR型頻率高于對(duì)照組[7], 但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異, 而KK型頻率低于對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算KK基因型的OR值發(fā)現(xiàn)[OR= 0.411, 95%CI 0.17～0.99], 基因型KK個(gè)體顯著減少患冠心病的危險(xiǎn), 提示KK基因型是蒙古族冠心病發(fā)病的一個(gè)保護(hù)因子。本實(shí)驗(yàn)研究表明, 內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群不僅KK基因型HDL-C水平明顯高于RR型, 而且其TG水平也明顯低于RR型。這說明KK型基因不僅可升高HDL-C水平[10],且亦可通過降低TG水平而發(fā)揮抗冠心病作用, 提示蒙古族ABCA1 R219K變異與血脂異常[11,12]及冠心病之間存在一定的關(guān)系。其發(fā)生機(jī)制為, HDL-C促進(jìn)膽固醇外流, 抑制血脂氧化, 抑制單核細(xì)胞克隆刺激因子和單核細(xì)胞趨化蛋白-1, 促進(jìn)纖維蛋白溶解, 加強(qiáng)前列環(huán)素的作用, 抑制血管平滑肌增生, 從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的作用。

M233V是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的ABCA1基因單核苷酸多態(tài)性, 這種基因型改變目前國內(nèi)外僅見一篇報(bào)道[13]。此位點(diǎn)為ABCA1基因第7號(hào)外顯子DNA序列中1092位上一個(gè)核苷酸G→A（A1092G）的改變, 它導(dǎo)致ABCAl蛋白233位氨基酸由甲硫氨酸突變?yōu)槔i氨酸（M233V）。60例蒙古族冠心病患者經(jīng)Ⅱ限制性內(nèi)切酶酶切分析發(fā)現(xiàn), 18例存在A1092G改變, 17例為MV型（AG型）, 1例為VV型（GG型）, 42例MM型（AA型）, MV型發(fā)生率為28.3%, VV型發(fā)生率為1.7%, MM型發(fā)生率為70.0%。55例對(duì)照組發(fā)現(xiàn)14例A1092G改變, 14例為MV型改變, 41例為MM型, MV型發(fā)生率為25.5%, MM型發(fā)生率為74.5%, 但各基因型在兩組間發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組均為MM型分布最廣, MV型次之, VV型最少。而本研究發(fā)現(xiàn)的1例VV型（GG型）在國內(nèi)外為首次報(bào)道。此外, MM型與MV型和VV型之間的血脂改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異, 說明這種新發(fā)現(xiàn)的基因型變異對(duì)冠心病和血脂的影響尚不確定?？赡芘c不同基因因素（同時(shí)存在其他基因位點(diǎn)的改變或調(diào)控基因的影響）、不同種族、不同民族以及生活飲食習(xí)慣和地域差異有關(guān), 更具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的大樣本研究工作來明確。

總之, 本研究結(jié)果提示,ABCAl基因R219K多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群冠心病的遺傳易感性相關(guān), 其中KK基因型是冠心病的保護(hù)因子。ABCA1基因中A219K可通過影響血液中HDL-C及TG的水平而影響冠心病的易感性,發(fā)揮對(duì)心血管的保護(hù)作用。新發(fā)現(xiàn)的ABCA1基因M233V MM型分布最廣, MV型次之, VV型最少。我們?cè)趦?nèi)蒙古地區(qū)蒙古族冠心病患者中首次發(fā)現(xiàn)了VV型（GG型）基因型變異, 但其對(duì)冠心病和血脂的影響尚不確定, 有待于在細(xì)胞生物表達(dá)和大樣本的研究中探討它的可能機(jī)制。

[1] Vaneck M, Singaraja RR, Ye D,. Macrophage ATP binding cassette transporter A1 overexpression inhibits atherosclerotic lesion progression in low density lipoprotein receptor knockout mice[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26 (4): 929-934.

[2] Attie AD. ABCA1: at the nexus of cholesterol, HDL and atherosclerosis[J]. Trends Biochem Sci, 2007, 32(4): 172- 179.

[3] Benton JL, Ding J, Tsai MY,. Associations between two common polymorphisms in the ABCA1 gene and subclinical atherosclerosis: Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis[J]. Atherosclerosis, 2007, 193(2): 352-360.

[4] Genvigir FD, Soares SA, Hirata MH,. Effects of ABCA1 SNPs, including the C-105T novel variant, on serum lipids of Brazilian individuals[J]. Clin Chim Acta, 2008, 389(1-2): 79-86.

[5] Slatter TL, Jones GT, Williams MJ,. Novel rare mutations and promoter haplotypes in ABCA1 contribute to low-HDL-C levels[J]. Clin Genet, 2008, 73(2): 179-184.

[6] Frikke-Schmidt R, Nordestgaard BG, Jensen GB,. Genetic variation in ABCA1 predicts ischemic heart disease in the general population[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2008, 28(1): 180-186.

[7] Doosti M, Najafi M, Reza JZ,. The role of ATP-binding-cassette-transporter-A1 (ABCA1) gene poly-mor-phism on coronary artery disease risk[J].Transl Res,2010, 155(4): 185-190.

[8] Andrikovics H, Pongrácz E, Kalina E,Decreased frequencies of ABCA1 polymorphisms R219K and V771M in Hungarian patients with cerebrovascular and cardio-vascular diseases[J]. Cerebrovasc Dis, 2006, 21(4): 254-259.

[9] 劉競(jìng)麗, 李勁頻, 汪曉玲. ABCA1基因R219K多態(tài)性與青年缺血性腦卒中的相關(guān)性研究[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 8(12): 1221-1225.

[10] 趙水平, 肖志杰, 聶 賽, 等. 冠心病患者ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子1基因R219K變異的研究[J].中華心血管病雜志, 2004, 32(8): 712-716.

[11] Li J, Wang LF, Li ZQ,Effect of R219K polymorphism of the ABCA1 gene on the lipid-lowering effect of pravastatin in Chinese patients with coronary heart disease[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol,2009, 36(5-6): 567-570.

[12] Kitjaroentham A, Hananantachai H, Tungtrongchitr A,. R219K polymorphism of ATP binding cassette transporter A1 related with low HDL in overweight/obese Thai males [J]. Arch Med Res, 2007, 38(8): 834-838.

[13] 郭志剛, 王琦光, 賴文巖, 等. 新發(fā)現(xiàn)的中國人ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1基因M233V單核苷酸多態(tài)性及其家系調(diào)查[J]. 中華心血管病雜志, 2006, 34(12): 1101-1104.

（編輯: 王雪萍）

A novel polymorphism in ABCA1 gene (M233V and R219K) in Mongolian nationality population

YUAN Tuoya, LIU Xiaoyu*, WANG Yuexi

(Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Inner Mongolia Medical College, Huhehot 010050, China)

To investigate ATP-binding cassette transporter 1(ABCA1) M233V and R219K gene polymorphism in Mongolian nationality population in Inner Mongolia region and its correlationship with blood lipids and coronary heart disease(CHD).The target fragments of ABCA1gene were amplified and analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragments length polymorphism(PCR-RFLP) technique in 115 Mongolian control subjects without CHD and patients with CHD.The subjects presented ABCA1 gene M233V polymorphism, which had three genotypes: MM genotype, MV genotype and VV genotype. There was no significant difference in frequency of allele and genotype in M233V polymorphism between controls and CHD patients(＞0.05).No significant difference was found in levels of total cholesterol(TC), triglyceride(TG), high density lipoprotein-cholesterol(HDL-C) and low density lipoprotein-cholesterol(LDL-C) between MM genotype and MV+VV genotype(＞0.05).The frequency of KK genotype was significantly higher in controls than in CHD patients(＜0.05). KK genotype had higher HDL-C level(＜0.05) and lower TG level than RR genotype (＜0.05).In Mongolian population in Inner Mongolia region, M233V is a novel polymorphism in ABCAl gene. ABCAl gene R219K polymorphism is associated with CHD risk．The KK genotype results in a beneficial profile of blood lipids, which may be a novel genetic marker for low risk of CHD.

coronary heart disease; ATP binding cassette transporter 1; polymorphism; Mongolian nationality

(20080404MS1135)

R541.4

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00026

2011-06-19;

2011-08-29

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(20080404MS1135)

劉曉宇, Tel: 0471-6636692, E-mail: xxggood1@126.com