花生四烯酸環(huán)氧化酶-2途徑參與丹參改善老年自發(fā)性高血壓大鼠的心肌纖維化

王建軍, 劉 杰

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花生四烯酸環(huán)氧化酶-2途徑參與丹參改善老年自發(fā)性高血壓大鼠的心肌纖維化

王建軍1*, 劉 杰2

（1南京軍區(qū)福州總醫(yī)院干部病房二科, 福州 350025;2華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科, 武漢 430022）

探討丹參對(duì)于老年自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）心肌纖維化的逆轉(zhuǎn)作用和可能的作用機(jī)制——花生四烯酸環(huán)氧化酶途徑。實(shí)驗(yàn)采用17個(gè)月齡的SHR分別連續(xù)給予12周的丹參注射液和生理鹽水對(duì)照, 選取同周齡的WKY大鼠作為正常對(duì)照, 同時(shí)選用花生四烯酸環(huán)氧化酶-2（COX-2）的特異性抑制劑塞來(lái)昔布灌胃處理后注射丹參。測(cè)定血壓、血流動(dòng)力學(xué)、左心室質(zhì)量指數(shù), HE染色和Masson染色分析心肌細(xì)胞的大小或心肌纖維化水平, 左心室心肌COX-2的蛋白表達(dá)和活性水平。與老年WKY大鼠相比, 老年SHR高血壓對(duì)照組血壓顯著增高[收縮壓: （171±12）（125±3）mmHg; 舒張壓: （115±9）（87±3）mmHg; 平均動(dòng)脈壓: （139±10）（106±5）mmHg;＜0.05], 心功能惡化[LVEDP: （13.9±1.7）（7.6±1.3）mmHg; LVdP/dtmax: （2528±167）（3015±217）mmHg/s; －LVdP/dtmax: （1957±134）（2501±175）mmHg/s,＜0.05], 左室質(zhì)量指數(shù)增加[（3.45±0.07）（2.23±0.06）mg/g,＜0.05], 心肌細(xì)胞增大[心肌細(xì)胞直徑: （23.5±0.4）（14.3±0.4）μm,＜0.05], 纖維化嚴(yán)重[心肌間質(zhì)纖維化指數(shù): （1.66±0.05）%（0.64±0.05）%; 心肌血管周?chē)w維化指數(shù): （139±9）%（68±7）%,＜0.05], 心肌COX-2的蛋白表達(dá)水平增加[（125.8±7.2）（47.6±3.8）,＜0.05]以及活性增強(qiáng)[（73.9±5.6）（56.7±4.4）kU/g,＜0.05]。應(yīng)用丹參的SHR組, 收縮壓無(wú)顯著變化, 其他指標(biāo)均有顯著下降（< 0.05）, 塞來(lái)昔布能夠部分消除丹參的作用。丹參能顯著逆轉(zhuǎn)老年SHR的心肌纖維化水平, 該作用可能是通過(guò)花生四烯酸環(huán)氧化酶途徑。

丹參; 大鼠, 近交SHR; 心肌纖維化; 花生四烯酸環(huán)氧化酶

高血壓左心室肥大是心肌纖維對(duì)于慢性的壓力或容量負(fù)荷的適應(yīng)性反應(yīng), 是高血壓患者發(fā)生充血性心力衰竭、冠心病、心律失常以及猝死等心血管事件的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素。肥大左心室中增加的膠原纖維的沉積使心功能不斷惡化, 繼而引起心力衰竭[1]。有效的降血壓藥物治療不僅能降低血壓, 更應(yīng)該能夠改善心肌的病理重構(gòu)或纖維化[2]。丹參具有多種心血管保護(hù)功能, 唐忠志等[3]研究表明, 丹參雖然不能有效地降低血壓, 但在預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化方面具有重要的作用。但丹參對(duì)于老年自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats, SHR）心肌纖維化的作用并不清楚, 而且逆轉(zhuǎn)纖維化的機(jī)制也并不清楚, 本實(shí)驗(yàn)旨在研究丹參對(duì)于老年SHR心肌的作用和可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

17個(gè)月的老年雄性SHR（北京維通利華公司）, 體質(zhì)量（418±6）g, 隨機(jī)分為高血壓對(duì)照組和高血壓丹參組。同期選擇17個(gè)月的老年雄性WKY大鼠作為對(duì)照, 體質(zhì)量（476±10）g。丹參組連續(xù)給予12周的丹參注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司提供）腹腔注射, 劑量為1ml/（kg·d）, 1ml注射液含丹參生藥1.5g, 即SMB-treated SHR。其他兩組大鼠分別連續(xù)給予12周相同容積的生理鹽水注射液。同時(shí), 為了進(jìn)一步觀察丹參的作用機(jī)制, 我們選擇了8只SHR大鼠, 在丹參注射液腹腔注射的同時(shí), 給予花生四烯酸環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）特異性抑制劑塞來(lái)昔布灌胃處理, 即Celecoxib-treated SHR。

1.2 血壓測(cè)定

采用無(wú)創(chuàng)大鼠尾動(dòng)脈壓測(cè)量連續(xù)每周檢測(cè)血壓和心率。血壓儀為澳大利亞Powerlab公司生產(chǎn)的ML125/R, 8sp生物信號(hào)采集與處理系統(tǒng)。每次測(cè)定血壓重復(fù)3次, 取平均值。

1.3 血流動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)

12周后每只大鼠稱重, 麻醉后頸部氣管插管接小動(dòng)物呼吸機(jī)維持呼吸。分離右側(cè)頸總動(dòng)脈, 用充有肝素生理鹽水溶液的PE-50聚乙烯管插入右側(cè)頸總動(dòng)脈, 經(jīng)PowerLab數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)記錄動(dòng)脈血壓, 并對(duì)血壓信號(hào)進(jìn)行處理, 同步記錄動(dòng)脈血壓。進(jìn)一步插管進(jìn)入左心室內(nèi), 記錄左室舒張末期壓力（left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP）、左室內(nèi)壓最大上升速率（LVdP/dtmax）用于評(píng)價(jià)心臟收縮功能, 左室內(nèi)壓最大下降速率（－LVdP/dtmax）用于評(píng)價(jià)心臟舒張功能。

1.4 左心室質(zhì)量指數(shù)

大鼠稱重后過(guò)量麻醉處死, 取出心臟用冰磷酸鹽緩沖液沖洗血污后稱重。剪去心房和右心室游離壁, 將左心室和室間隔準(zhǔn)確稱重。計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)（heart mass/body mass, HM/BM）和左心室質(zhì)量指數(shù)（left ventricular mass/body mass, LVM/BM）。

1.5 病理切片

靜脈注射過(guò)量的氯化鉀注射液使心臟收縮停止于舒張期, 快速將心臟取出并用冰磷酸鹽緩沖液（pH7.4）沖洗。心臟置于4%中性福爾馬林溶液中室溫固定8～12h, 然后梯度乙醇脫水。取左心室中部冠狀切面包埋于石蠟中, 石蠟切片機(jī)上做5μm切片, HE染色, Masson's染色。HE染色用于觀察單個(gè)心肌細(xì)胞直徑, Masson's染色用于評(píng)價(jià)心肌纖維化水平。心肌纖維化分為心肌間質(zhì)纖維化和心肌血管周?chē)w維化, 二者共同評(píng)價(jià)心肌纖維化水平[4]。

1.6 Western 免疫印跡法檢測(cè)心肌COX-2蛋白表達(dá)

速取處死動(dòng)物, 取出心臟左室前壁心肌, 液氮中冷凍, 保存于-80℃?zhèn)溆?。提取所取心肌中的蛋? BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。從每組標(biāo)本蛋白質(zhì)樣品中取50μg, 凝膠電泳分離, 轉(zhuǎn)膜, 封閉后加入兔抗COX-2的單克隆抗體（Canda, Santa Cruz）。再加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體, 最后加入ECL試劑一曝光。使用β-Actin作為內(nèi)參。將Western blot條帶進(jìn)行光密度值掃描。COX-2的表達(dá)方式: COX-2光密度/β-Actin光密度。

1.7 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)外周血COX-2活性

使用酶聯(lián)免疫（ELISA）的方法檢測(cè)心肌COX-2活性, 試劑盒為西班牙Cayman公司, 批號(hào)為760151的COX-2試劑盒。按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作后, 使用美國(guó)Bio-tek公司的ELX800NB 酶標(biāo)儀讀取。標(biāo)準(zhǔn)曲線R值為0.9935。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有指標(biāo)均用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示, 采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn), SNK法做兩兩比較。以< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 丹參對(duì)血壓和心率的影響

高血壓組大鼠收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓明顯高于WHY大鼠, 且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。在連續(xù)12周的檢測(cè)中, 四組血壓很平穩(wěn), 丹參組、塞來(lái)昔布組與高血壓組比較, 收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05; 表1）。

2.2 丹參對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響

高血壓大鼠的血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定表明, 部分老年高血壓大鼠心力衰竭, 心功能較差, 丹參可以改善高血壓大鼠的心功能, 改善LVEDP、LVdP/dtmax、－LVdP/dtmax; 塞來(lái)昔布對(duì)SHR的LVEDP、－LVdP/ dtmax有顯著改善作用, 但對(duì)LVdP/dtmax沒(méi)有影響, 說(shuō)明其可以取消丹參對(duì)心臟舒張功能的影響, 但不能取消丹參對(duì)心臟收縮功能的影響（表1）。

表1 四組的血流動(dòng)力學(xué)指數(shù)

注: SBP: 收縮壓; DBP: 舒張壓; MAP: 平均動(dòng)脈壓; LVEDP: 左室舒張未壓; SHR: 自發(fā)性高血壓大鼠。與WKY組比較,*＜0.05; 與SHR組比較,#＜0.05

2.3 丹參對(duì)心臟解剖學(xué)指標(biāo)的影響

高血壓大鼠的心臟質(zhì)量及體質(zhì)量比明顯高于正常對(duì)照組, 顯示老年SHR呈現(xiàn)嚴(yán)重的左心室肥大。丹參對(duì)SHR 的體質(zhì)量并無(wú)改善, 但可以明顯降低左心室質(zhì)量和左心室質(zhì)量指數(shù)。塞來(lái)昔布能夠取消丹參對(duì)左心室質(zhì)量的影響, 但未能取消丹參對(duì)左心室質(zhì)量指數(shù)的影響（表2）。

表2 四組的解剖學(xué)指標(biāo)

注: BM: 體質(zhì)量; LVM: 左室質(zhì)量; LVMI: 左室質(zhì)量指數(shù); SHR: 自發(fā)性高血壓大鼠。與WKY組比較,*＜0.05; 與SHR組比較,#＜0.05

2.4 丹參對(duì)心臟病理學(xué)指標(biāo)的影響

心肌HE染色表明, 丹參可以降低SHR的心肌細(xì)胞直徑, 塞來(lái)昔布不能取消丹參對(duì)心肌細(xì)胞直徑的降低作用（圖1）。Masson染色表明, 丹參可以改善心臟的纖維化, 尤其是改善心肌內(nèi)血管周?chē)睦w維化, 塞來(lái)昔布可以取消丹參改善心肌血管周?chē)w維化的作用（圖2）。四組的組織病理學(xué)指標(biāo)情況見(jiàn)表3。

2.5 心肌組織COX-2的表達(dá)水平

Western blot結(jié)果表明, SHR心肌組織中COX-2的蛋白表達(dá)水平增加。應(yīng)用丹參后, SHR心肌組織中的COX-2水平降低, 塞來(lái)昔布能夠取消該作用（圖3）。

2.6 心肌組織COX-2的活性

ELISA結(jié)果表明, SHR心肌組織中COX-2的活性增加（＜0.05）。應(yīng)用丹參后, SHR心肌組織中的COX-2活性降低, 塞來(lái)昔布能夠取消該作用（表4）。

圖1 四組心肌的心肌細(xì)胞直徑比較

Figure 1 Myocardial cell diameter of four groups (HE staining′200)

A: WKY; B: SHR; C: 丹參處理SHR; D: 塞來(lái)昔布處理SHR

圖2 四組心肌的心肌纖維化水平比較

Figure 2 Myocardial fibrosisoffour groups(Masson staining′200)

A,E: WKY; B,F: SHR; C,D: 丹參處理SHR; D,H: 塞來(lái)昔布處理SHR; A,B,C,D: 顯示心肌間質(zhì)纖維化; E,F,G,H: 顯示心肌血管周?chē)w維化

表3 四組的組織病理學(xué)指標(biāo)

注: 與WKY比較,*＜0.05, 與SHR比較,#＜0.05

圖3 Western blot檢測(cè)COX-2蛋白表達(dá)情況

Figure 3 COX-2 protein expression by Western blot (=8)

表4 COX-2的活性及表達(dá)情況

注: COX-2: 環(huán)氧化酶; SHR: 自發(fā)性高血壓大鼠。與WKY比較,*＜0.05; 與SHR比較,#＜0.05

3 討 論

長(zhǎng)期的高血壓會(huì)導(dǎo)致左心室肥厚, 高血壓左心室肥厚主要表現(xiàn)為左心室質(zhì)量指數(shù)增加, 心肌細(xì)胞肥大, 心肌的纖維化。心肌的纖維化可以分為心肌間質(zhì)的纖維化和心肌血管周?chē)睦w維化[5]。持久的高血壓和心肌的纖維化增加了非心肌細(xì)胞在心臟中所占的比例, 對(duì)于心臟的收縮和舒張功能產(chǎn)生顯著的負(fù)面影響, 最終會(huì)導(dǎo)致心力衰竭, 這在老年性長(zhǎng)期高血壓中更明顯。

SHR是目前公認(rèn)的最接近于人類(lèi)原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型, 在13周時(shí)血壓已近于穩(wěn)定, 在老年時(shí)會(huì)出現(xiàn)不同程度的左心衰竭和明顯的心肌纖維化, 是良好的研究左心室心肌纖維化的動(dòng)物模型[6]。中藥抗纖維化一直是值得關(guān)注和研究的應(yīng)用領(lǐng)域, 丹參作為傳統(tǒng)的中藥, 含有重要的心血管活性成分丹參酮ⅡA, 具有較強(qiáng)的抗氧化, 清除自由基, 改善微循環(huán)的作用。諸多研究明確表明, 丹參具有能抵抗肝臟的損傷和抗肝纖維化的作用[7]。研究表明, 丹參可能通過(guò)降低腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng), 達(dá)到預(yù)防和逆轉(zhuǎn)纖維化, 改善心內(nèi)皮細(xì)胞的功能[3]。雖然機(jī)制并不十分明確, 但丹參降低和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的作用已十分明確。很多降壓藥物對(duì)于老年性頑固性高血壓患者作用并不十分遂愿, 因此我們研究了丹參對(duì)于老年高血壓大鼠的作用。研究表明, 丹參也可以有效地改善并部分逆轉(zhuǎn)左心室的肥厚和心肌的纖維化, 對(duì)于心肌血管周?chē)睦w維化尤其明顯。

本實(shí)驗(yàn)表明, 丹參能顯著降低左心室質(zhì)量指數(shù), 減小心肌細(xì)胞的直徑和面積, 降低了心肌的間質(zhì)纖維化和血管周?chē)睦w維化。心肌的病理改變除了要考慮組織解剖學(xué)的改變, 也要考慮功能的改善。因此我們也研究了丹參對(duì)于左心室功能的影響, 研究表明, 老年SHR呈現(xiàn)了一定程度的心力衰竭, LVEDP平均值大于13 mmHg, 丹參可以有效地降低了LVEDP, 改善左心室的收縮功能。本研究血壓測(cè)定結(jié)果表明, 丹參并未能有效地降低高血壓大鼠的血壓, 這與鄭智[8]等研究類(lèi)似, 說(shuō)明丹參并不能改變高血壓大鼠的心臟負(fù)荷, 但李偉等[9]研究發(fā)現(xiàn)白花丹參能夠顯著降低SHR的血壓波動(dòng)性, 提高壓力感受器的敏感性。而血壓的波動(dòng)性與心、腦、腎等器官損傷的程度密切相關(guān), 對(duì)于高血壓靶器官和并發(fā)癥的預(yù)防和治療具有重要的作用。

在心肌纖維化的形成過(guò)程中, 炎癥起了至關(guān)重要的作用。炎癥細(xì)胞可以釋放花生四烯酸, 花生四烯酸有三條代謝途徑: 經(jīng)環(huán)氧化酶代謝形成前列環(huán)素及血栓素A等; 經(jīng)脂加氧酶代謝產(chǎn)生白三烯及羥基廿碳四烯酸; 經(jīng)細(xì)胞色素P450（CYP）途徑代謝為廿烷四烯酸及表氧化廿碳三烯酸。COX-2代謝途徑是目前研究最明確的心肌間質(zhì)纖維化形成的途徑[10]。為了證明COX-2途徑通路參與了丹參抑制高血壓心肌纖維化的作用, 作者進(jìn)一步使用了特異性抑制劑塞來(lái)昔布阻斷花生四烯酸環(huán)氧化酶信號(hào)通路, 觀察阻斷該途徑是否可取消丹參的作用, 研究表明, COX-2抑制劑能部分消除丹參抑制老年SHR的心肌纖維化的作用。作者認(rèn)為除了COX-2參與丹參抑制心肌纖維化之外, 還有其他途徑共同參與了高血壓心肌纖維化的途徑, 如研究報(bào)道基質(zhì)金屬蛋白酶途徑、腫瘤壞死因子途徑等均參與了高血壓的心肌纖維化途徑。本研究選取了在丹參抗纖維化作用中發(fā)揮重要作用的COX-2途徑, 以觀察花生四烯酸環(huán)氧化酶信號(hào)通路在丹參抗心肌纖維化的作用。研究發(fā)現(xiàn), 丹參能夠降低COX-2的表達(dá), 說(shuō)明丹參可能是通過(guò)COX-2途徑改善老年SHR心肌纖維化的。

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（編輯: 周宇紅）

Cyclooxygenase-2 pathway in reversion of myocardial fibrosis by Salvia Miltiorrhiza Bge (SMB) in senescent spontaneously hypertensive rats

WANG Jianjun1*, LIU Jie2

(1Cadre￠s Ward, Fuzhou General Hospital, Nanjing Military Command, Fuzhou 350025, China;2Deparment of Cardiology, Union Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China)

To explore the roles of Salvia Miltiorrhiza Bge (SMB) in improving myocardial fibrosis in aged spontaneously hypertensive rats and the possible mechanisms ——cyclooxygenase pathway of arachidonic acid.The 17-month-old SHR rats were given consecutive SMB injection or saline control for 12 weeks, while the age-matched WKY rats were selected as normal control. Meanwhile, celecoxib, the specified arachidonic acid cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor, was administrated intragastrically before SMB injection. The blood pressure, hemodynamic index and left ventricular mass index were determined. HE staining and Masson staining were performed to analyze the size of myocardial cells or the level of myocardial fibrosis, as well as left ventricular myocardial expression and activity level of COX-2 protein.Compared with the elderly WKY rats, senescent SHR had higher blood pressure[systolic blood pressure: (171±12)(125±3)mmHg; diastolic blood pressure: (115±9)(87±3)mmHg; mean artery pressure: (139±10)(106±5)mmHg,＜0.05], deterious heart function[LVEDP: (13.9±1.7)(7.6±1.3)mmHg; LVdP/dtmax: (2528±167)(3015±217)mmHg/s;-LVdP/dtmax: (1957±134)(2501±175)mmHg/s,＜0.05], increased left ventricular mass index[(3.45±0.07)(2.23±0.06)mg/g,＜0.05], increased myocardial cells[diameter: (23.5±0.4)(14.3±0.4)μm,＜0.05], severe fibrosis[myocardialinterstitial fibrosis index: (1.66±0.05)%(0.64±0.05)%; myocardial perivascularfibrosis index: (139±9)%(68±7)%,＜0.05], elevated expression[(125.8±7.2)(47.6±3.8),＜0.05] and activity level of myocardial COX-2 protein[(73.9±5.6)(56.7±4.4)kU/g,＜0.05]. Except the systolic blood pressure, other indicators in SMB-treated SHR were significantly reduced. The administration of celecoxib partially abolished the effect of SMB.SMB therapy can reverse myocardial fibrosis in senescent spontaneously hypertensive rats, which may be through cyclooxygenase pathway.

Salvia Miltiorrhiza Bge; spontaneously hypertensive rats; myocardial fibrosis; cyclooxygenase pathway of arachidonic acid

Q463; R541.3

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00032

2011-07-14;

2011-10-10

王建軍, Tel: 0591-22859354, E-mail: wjjun1991@sina.com