神經(jīng)肽Y對海馬神經(jīng)元“癲癇樣”動作電位的影響

董長征董秀芳孔艷莉陳堯趙磊李哲趙文清李文玲

神經(jīng)肽Y對海馬神經(jīng)元“癲癇樣”動作電位的影響

董長征*董秀芳△孔艷莉*陳堯*趙磊*李哲*趙文清*李文玲*

【摘要】目的 探討神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）對海馬神經(jīng)元“癲癇樣”動作電位的影響。方法 用無鎂細胞外液處理原代培養(yǎng)12 d的海馬神經(jīng)元3 h，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元癲癇樣放電，建立海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型；用全細胞膜片鉗電流鉗模式檢測神經(jīng)元動作電位，分別給予0.1 μmol／L和1 μmol／L NPY各1 μL，給藥時間 10 s，觀察其對神經(jīng)元動作電位頻率及波幅的影響。結(jié)果 無鎂細胞外液處理神經(jīng)元3 h，可以形成穩(wěn)定的海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型，頻率16～23 Hz，波幅75～96 mV。模型組神經(jīng)元動作電位頻率為（18.00±2.32）Hz，而0.1 μmol／L和1 μmol／L NPY組分別為（4.75±1.04）Hz和（1.50±0.75）Hz。與模型組相比較，兩種濃度NPY組均降低了動作電位發(fā)放的頻率 （P＜0.05）。模型組神經(jīng)元動作電位波幅為 （82.25±5.17）mV， 而0.1 μmol／L和1μmol／L NPY組分別為（49.75±2.49）mV和（40.00±2.20）mV。與模型組相比較，兩種濃度NPY組均降低了動作電位發(fā)放的波幅（P＜0.05）。兩種濃度NPY之間相比較，也有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。1 μmol／L NPY明顯抑制了動作電位發(fā)放的頻率和波幅。結(jié)論 NPY能夠抑制無鎂細胞外液誘發(fā)的神經(jīng)元癲癇樣電活動，為應(yīng)用NPY抑制癲癇發(fā)作提供了細胞電生理學(xué)證據(jù)。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)肽Y 癲癇 神經(jīng)元 動作電位 全細胞膜片鉗記錄

神經(jīng)肽Y（neuropeptide，NPY），全名神經(jīng)肽酪氨酸，由36個氨基酸組成的多肽。Tatemoto等［1］于1982年首先在豬腦中提取。作為廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，NPY被認為具有抗癲癇發(fā)作的作用。前期動物實驗已證實利用腺相關(guān)病毒載體將NPY基因轉(zhuǎn)移至腦內(nèi)，通過基因轉(zhuǎn)染的方法可以減輕紅藻氨酸致癇大鼠的發(fā)作程度［2］。神經(jīng)元動作電位是指神經(jīng)元受到外界刺激時在靜息電位的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的可擴布的電位變化過程，反映了機體神經(jīng)元的興奮性，與癲癇發(fā)病的生理機制密切相關(guān)。目前為止，NPY抑制癲癇發(fā)作的細胞分子學(xué)機制仍不十分清楚。本研究以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型為基礎(chǔ)，研究NPY對海馬神經(jīng)元癲癇動作電位的影響，探討NPY抑制癲癇發(fā)作的細胞分子學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 新生24 h Wistar大鼠15只，由英國利茲大學(xué)生物系實驗動物中心提供。主要試劑和儀器：Neurobasal TM，胎牛血清（FBS），胰蛋白酶（Trypsin），L-多聚賴氨酸，N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸均購自GIBCO公司，氯化鎂（MgC12·6H2O）分析純 （Fisher Scientific，UK），膜片鉗放大器（Axon patch 200B，USA），模／數(shù)轉(zhuǎn)換器 （Digidata 1320A 16-bit Aequisition System， USA），灌流控制系統(tǒng)BPS-8（Axon， USA）， 倒置顯微鏡Olympus CK2（Olympus，Japan）。

1.2 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng) 在解剖顯微鏡輔助下，分離新生24 h Wistar大鼠雙側(cè)海馬組織，根據(jù)參考文獻［3］的方法，進行原代神經(jīng)元培養(yǎng)，細胞數(shù)調(diào)整為2×105cells／mL，然后將細胞接種于細胞培養(yǎng)皿，在CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。自第6 d起，用加入10 μmol／L阿糖胞苷（Ara-C）抑制膠質(zhì)細胞生長。培養(yǎng)12 d的細胞用于后續(xù)膜片鉗試驗。

1.3 神經(jīng)元癲癇樣放電模型的建立 將培養(yǎng)12 d的海馬神經(jīng)元，用無鎂（Mg2＋free）細胞外液處理3 h，用于后續(xù)膜片鉗試驗。采用EPC-10膜片鉗系統(tǒng)進行全細胞模式的電流鉗記錄神經(jīng)元的動作電位，若出現(xiàn)自發(fā)的穩(wěn)定的癲癇樣異常放電形式，說明造模成功。正常細胞外液組成成分：NaCl 147 mmol／L，HEPES 10 mmol／L，Glucose 13 mmol／L，KCl 2 mmol／L，CaCl22 mmol／L，MgCl22 mmol／L；用5 mmol／L NaOH調(diào)節(jié) pH至 7.3，調(diào)整滲透壓為280～320 mOsm／L。無鎂細胞外液組成成分：NaCl 147 mmol／L，HEPES 10 mmol／L，Glucose 13 mmol／L，KC1 2 mmol／L，CaCl22 mmol／L；用5 mmol／L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.3，調(diào)整滲透壓為280～320 mOsm／L。培養(yǎng)的神經(jīng)元被分為3組：模型組（Mg2＋free組），NPY（0.1 μmol／L）干預(yù)組，NPY（1 μmol／L）干預(yù)組。模型組只用無鎂細胞外液處理3 h；NPY（0.1 μmol／L）干預(yù)組， 在神經(jīng)元癲癇樣放電模型建立成功后，給予0.1 μmol／L NPY；NPY（1 μmol／L）干預(yù)組，在神經(jīng)元癲癇樣放電模型建立成功后，給予1 μmol／L NPY。

1.4 全細胞膜片鉗模式記錄海馬神經(jīng)元動作電位

1.4.1 記錄動作電位的電極內(nèi)液 記錄動作電位的電極內(nèi)液組成成分：KCl 147 mmol／L，MgC122 mmol／L，HEPES 10 mmol／L，EGTA 1 mmol／L；用3 mmmol／L KOH調(diào)節(jié)pH至7.3，調(diào)整滲透壓為280～320 mOsm／L。實驗前用孔徑0.22 μm的一次性針頭濾器過濾滅菌。

1.4.2 全細胞膜片鉗記錄模式 選擇美國WPI公司生產(chǎn)的電導(dǎo)率高且噪聲低的有芯膜片鉗玻璃管，用PP-830型電極拉制儀（Electrode Puller）分兩步法拉制而成，入液的電阻值為6～8 MΩ。在微操縱器輔助下，將微電極吸附在神經(jīng)元細胞膜上，形成高阻封接后，負壓破膜，形成細胞內(nèi)液與電極內(nèi)液相通的全細胞記錄模式。實驗在室溫（23℃～25℃）條件下進行。

1.4.3 電流鉗模式下記錄海馬神經(jīng)元的動作電位

設(shè)定參數(shù)：記錄模式為C-Clamp，Gain 2 mv／PA，C-fast 7.86 pF， C-Slow 50.00 pF， Amplitude 5.0 mV，length 5.0 ms，Imembrane 0 pA。先檢測無鎂細胞外液處理后神經(jīng)元的動作電位，通過灌流給藥系統(tǒng)分別給予0.1 μmol／L和1 μmol／L NPY干預(yù)10 s， 然后再次記錄神經(jīng)元動作電位的頻率和波幅，實驗數(shù)據(jù)由pClamp 9.0軟件采樣系統(tǒng)獲得，直接進入Clamfit 9.0軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行測量、分析、作圖。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SAS 8.0進行分析。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差±s）表示，采用方差分析及q檢驗，α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué) 體外培養(yǎng)神經(jīng)元第12 d的海馬神經(jīng)元在倒置顯微鏡下觀察可見：細胞周圍有光暈，胞體略突出飽滿、折光性良好，細胞突起長而相互連接，彼此間廣泛突觸聯(lián)系形成（圖1）。選取形態(tài)一致的多角形，胞體飽滿，周圍帶光暈發(fā)育良好神經(jīng)元用于后續(xù)膜片鉗試驗。

2.2 海馬神經(jīng)元無鎂細胞外液處理前后動作電位的變化 在全細胞電流鉗記錄模式下操作，體外培養(yǎng)正常海馬神經(jīng)元可見自發(fā)性興奮性突觸后電位，偶有動作電位發(fā)放，見圖2；無鎂細胞外液處理神經(jīng)元3 h后，可檢測到頻發(fā)的動作電位發(fā)放，頻率16～23Hz，波幅75～96m V，見圖3。

2.3 NPY對海馬癲癇樣神經(jīng)元動作電位的影響全細胞電流鉗記錄結(jié)果顯示：模型組神經(jīng)元動作電位頻率為（18.00±2.32）Hz，而0.1μmol／L和1μmol／L NPY組分別為（4.75±1.04）Hz和（1.50± 0.75）Hz，與模型組相比較，兩種濃度NPY組均降低了動作電位發(fā)放的頻率（q分別為 3.98、4.25，P＜0.05）。模型組神經(jīng)元動作電位波幅為（82.25 ±5.17）mV，而0.1 μmol／L和1 μmol／L NPY組分別為（49.75±2.49）mV和（40.00±2.20）mV，與模型組相比較，兩種濃度NPY組均降低了動作電位發(fā)放的波幅 （q分別為3.45、3.86，P＜0.05）。0.1 μmol／L NPY給藥后動作電位的頻率和幅度降低的程度小于1 μmol／L NPY組神經(jīng)元，統(tǒng)計學(xué)分析有統(tǒng)計學(xué)差異（q分別為3.52、3.41，P＜0.05）。結(jié)果見圖4、5，表1。

表1 各組海馬神經(jīng)元動作電位頻率和波幅（±s）

表1 各組海馬神經(jīng)元動作電位頻率和波幅（±s）

1）與模型組相比，經(jīng)q檢驗，P＜0.052）與NPY 0.1 μmol／L組相比，經(jīng)q檢驗，P＜0.05

組別模型組NPY 0.1 μmol／L組NPY 1 μmol／L組n888頻率（Hz）18.00±2.32 4.75±1.041）1.50±0.751），2）波幅（mV）82.25±5.17 49.75±2.491）40.00±2.201），2）

3 討論

文獻報道去除細胞外的 Mg2＋［4］或通過用印防己苦毒素（picrotoxin）封閉GABA受體［5］從而誘發(fā)出神經(jīng)元急性發(fā)作間期放電 （Interictal bursting）。Mg2＋在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常電生理活動和神經(jīng)元的興奮性具有重要作用，它能夠阻滯鈣離子細胞內(nèi)流，減少細胞損傷；還能拮抗如谷氨酸、天冬氨酸等興奮性氨基酸的作用，抑制細胞去極化；Mg2＋還參與Na＋-K＋-ATP酶的形成，維護細胞膜的穩(wěn)定性而阻止癲癇的發(fā)作。因此，移除細胞生存環(huán)境的Mg2＋，可以誘發(fā)神經(jīng)元的高興奮性狀態(tài)，模擬神經(jīng)元異常放電。Sombati等研究提示無鎂誘發(fā)的神經(jīng)元出現(xiàn)自發(fā)性反復(fù)性發(fā)放的動作電位與臨床癲癇發(fā)作時的電生理活動極為類似，抗癲癇藥物如苯妥英鈉能抑制這類動作電位的發(fā)生［6］。本研究根據(jù)上述鎂離子的生理特性，移除細胞外液鎂離子來模擬“癲癇微環(huán)境”，誘導(dǎo)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元癲癇樣放電。結(jié)果顯示經(jīng)無鎂細胞外液處理3 h后，神經(jīng)元都出現(xiàn)頻發(fā)的高波幅動作電位發(fā)放，證實了此癲癇神經(jīng)元放電模型的可靠性，適合用于膜片鉗電生理檢測。

圖1 培養(yǎng)12 d海馬神經(jīng)元（×400），bar＝30 μm

圖2 正常海馬神經(jīng)元動作電位

圖3 無鎂細胞外液處理3 h后海馬神經(jīng)元的動作電位

圖4 0.1 μmol／L NPY給藥后海馬神經(jīng)元動作電位

圖5 1 μmol／L NPY給藥后海馬神經(jīng)元動作電位

良好的神經(jīng)元活性是神經(jīng)電生理實驗的前提基礎(chǔ)。我們采用原代培養(yǎng)12d的海馬神經(jīng)元進行電生理研究，因為此時培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元貼壁后形成許多突起，彼此之間形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，表明培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元在體外仍能形成廣泛的突觸聯(lián)系，具備突觸間生物信息傳遞的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，能很好模擬在體神經(jīng)元的生理狀態(tài)，為神經(jīng)元細胞分子水平的研究提高良好基礎(chǔ)。

在體癲癇模型證實NPY具有較確切的抗驚厥作用。大鼠海馬組織中GABA受體被印防己苦毒素（picrotoxin）阻斷后，將NPY注射入被印防己苦毒素誘發(fā)的大鼠模型腦海馬CA1區(qū)可以抑制動物癲癇發(fā)作［7］。在紅藻氨酸（KA）誘發(fā)癲癇模型中將NPY注入到側(cè)腦室能有效抑制運動性癲癇的發(fā)作，并能夠大幅度縮短在海馬齒狀回和CA3區(qū)記錄到的由紅藻酸誘發(fā)的發(fā)作期癲癇異常腦電［8］。癲癇的本質(zhì)是大腦神經(jīng)元的異常超同步化放電，那么，NPY能否對對海馬神經(jīng)元癲癇樣放電產(chǎn)生抑制作用，是本研究的關(guān)鍵所在。2011年Stjepana Kovac報道：1滋mol／L NPY可以降低大鼠海馬腦片雙脈沖刺激引起神經(jīng)元癲癇樣放電的波幅和頻率，而對鼠腦額葉皮層放電無影響［9］。上述研究應(yīng)用腦片作為觀察對象，而對培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的影響并未涉及。本實驗以培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元作為研究對象，同樣選擇1滋mol／LNPY進行研究，為了進一步了解不同濃度NPY對實驗的影響，選擇0.1滋mol／L NPY進行對照。試驗結(jié)果顯示：兩種濃度的NPY均能夠抑制癲癇樣海馬神經(jīng)元的動作電位發(fā)放，與給藥前相比能夠降低其動作電位的頻率和幅度，發(fā)揮抑制神經(jīng)元異常放電的作用。并且，NPY抑制作用還具有濃度依賴性，在一定范圍內(nèi)，濃度越高抑制作用越強。本實驗1滋mol／L NPY對無鎂誘發(fā)的高波幅動作電位的抑制率要比0.1滋mol／L NPY要高，頻率降低也更多，但是在目前濃度下并沒有徹底抑制住動作電位的發(fā)放?？赡芘c給藥的濃度和持續(xù)時間均有關(guān)系。實驗不足之處在于僅僅觀察了兩種濃度NPY對神經(jīng)元放電的影響，NPY的有效作用范圍有待進一步確定細化?？傊?，本研究初步結(jié)果從細胞電生理水平證實了NPY具有抑制海馬神經(jīng)元癲癇樣放電的特性，為臨床應(yīng)用NPY進行抗癲癇治療提供了更多的實驗證據(jù)。

致謝：衷心感謝英國利茲大學(xué)江林華教授對本課題在膜片鉗記錄方面給予的技術(shù)指導(dǎo)。

參考文獻

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（責任編輯：甘章平）

* 河北省人民醫(yī)院功能神經(jīng)外科（石家莊 050051）

△ 邢臺市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

【中圖分類號】R742.1

【文獻標識碼】A

收稿日期：（2012－05－26）

doi：10.3969／j.issn.1002－0152.2012.08.006

通訊作者（E-mail：liwelling＠163.com）

The expression of neuropeptide Y on action potential in hippocampal epileptic neurons.

DONGChangzheng，DONG Xiufang，KONG Yanli，CHEN Yao，ZHAO Lei，LI Zhe，ZHAO Wenqing，LIN Wenling.Department of Functional Neurosurgery，Hebei General Hospital，No.348 Heping West Road，Shijiazhuang 050051，China.Tel：0311－85989935.

【Abstract】Objective To investigate the effects of NPY on action potential of the hippocampal epileptic neurons in rats.Methods E12 rat primary hippocampal neurons were exposed to magnesium-free solution for 3 h to establish the model of＂epileptic neuron.Whole cell current clamp was used to detect action potentials of the hippocampal epileptic neurons.The frequency and amplitude of neuronal action potential were recorded following treatment with 0.1 μM and 1 μM NPY for 10 s.Results A stable model of epileptiform discharges at frequency 16～23 Hz and amplitude 75～96 mV was successfully created by exposure of the hippocampal neurons to magnesium-free extracellular fluid for 3 h.The frequency of action potential was 18.00±2.32 Hz in the model group，4.75±1.04 Hz in the 0.1μmol／L NPY group and 1.50±0.75 Hz in the 1μmol／L NPY group， respectively.Compared with the model group，the frequency of action potential was significantly decreased in both NPY groups（P＜0.05）.The amplitude of action potential in the model group was 82.25±5.17 mV in the model group， 49.75±2.49 mV in the 0.1 μmol／L NPY group and 40.00±2.20 mV in the 1 μmol／L NPY group，respectively.Compared with the model group，the amplitude of action potential was significantly decreased in both NPY groups（P＜0.05）.The inhibitory effects on the frequency and amplitude of action potential were more pronounced in 1 μmol／L NPY group than in 0.1 μmol／L NPY group（P＜0.05）.Conclusion NPY can inhibit neuronal epileptiform activity induced by magnesium-free extracellular solution，which provides evidence of cell electrophysiology for NPY application in treatment of seizures.

【Key words】Neuropeptide Y Epilepsy Neuron Action Potential Whole cell patch clamp recording