水稻逆境響應(yīng)基因OsMsr11的克隆與分析

胡葉平，崔延春，徐國云，王曼玲，李落葉，夏新界

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，世界上60%的人口以其為主食[1]，在我國水稻也是第一大糧食作物，但是水稻在生產(chǎn)過程中常常遭遇季節(jié)性，區(qū)域性的干旱、高溫、低溫等逆境脅迫，嚴(yán)重影響我國水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。由于全球氣候變化和全球沙漠化進(jìn)程的加速，非生物脅迫將會加劇，因此，研究水稻對逆境的適應(yīng)機(jī)理，發(fā)掘新的水稻耐逆基因，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)培育出能適應(yīng)暫時不利條件或者能生活在嚴(yán)酷條件下的水稻品種已成為當(dāng)今水稻分子育種家聚焦的重點之一。

植物在遭受低溫、高溫、干旱等逆境脅迫時，會引起許多相關(guān)基因表達(dá)的變化，導(dǎo)致一系列形態(tài)學(xué)、生理代謝功能、生物化學(xué)以及分子上的改變，這些變化直接或間接影響植物自身的生長和產(chǎn)量。首先，植物為了適應(yīng)環(huán)境，在長期演化過程中形成了一系列對環(huán)境脅迫的抵抗或忍耐能力，即植物的耐逆性；其次，植物在逆境脅迫時，會引起耐逆相關(guān)基因表達(dá)的變化，一類是直接參與代謝與生理變化的效應(yīng)基因，它們通過控制代謝酶或蛋白的表達(dá)影響代謝與生理過程，這些酶或蛋白對維持細(xì)胞膜系統(tǒng)在逆境下的穩(wěn)定性以及防止原生質(zhì)過度脫水等有重要作用；另一類是調(diào)節(jié)基因[2]，它們通過控制其下游許多逆境誘導(dǎo)基因的表達(dá)而間接影響代謝與生理過程。研究表明某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也參與逆境反應(yīng)，但是目前有關(guān)非生物逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中受體的信息是非常有限的[3]。例如，反向遺傳學(xué)研究表明AHK1/ATHK1（擬南芥跨膜組氨酸激酶）在酵母細(xì)胞中是一個滲透反應(yīng)受體[4，5]，但是其下游信號傳導(dǎo)機(jī)制大部分都未知，這還需要科學(xué)家的進(jìn)一步研究。

由于分子生物學(xué)技術(shù)和方法在植物學(xué)中的應(yīng)用，許多耐逆相關(guān)基因已經(jīng)從各種植物中分離出來，功能也逐漸清楚。例如，Goel等[6]發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌codA基因在轉(zhuǎn)基因番茄中表達(dá)可以誘導(dǎo)甜菜堿的合成并能提高植株對鹽脅迫和水分脅迫的抵抗力；Lee等[7]報道的胡椒CaAMP1基因在擬南芥中過量表達(dá)能夠增加轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽、耐旱性。基因OsMsr2[8]在苗期葉片和孕穗期穗在低溫脅迫下，表達(dá)水平分別上調(diào)約52.3倍和68.2倍，研究表明該基因編碼鈣結(jié)合蛋白，在擬南芥中過量表達(dá)此基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性、耐旱性，還增加了對外源ABA的敏感性。所有這些耐逆基因的編碼產(chǎn)物直接保護(hù)植物細(xì)胞免受逆境脅迫或者調(diào)控其他基因的表達(dá)而提高植物對逆境的忍受能力[9,10]。雖然許多耐逆基因已被分離，但鑒于眾多基因參與逆境反應(yīng)和眾多耐逆基因的存在，克隆更多新的植物耐逆基因并了解它們的功能，無論是對研究植物耐逆性分子機(jī)理還是對作物的遺傳改良都具有重要的理論和實際意義。本文是在分析水稻全基因組耐逆反應(yīng)基因芯片數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，篩選出的其中一個耐逆相關(guān)基因，為研究其在耐逆反應(yīng)中的作用，對該基因進(jìn)行了序列分析和克隆、構(gòu)建了過量表達(dá)載體、采用農(nóng)桿菌侵染法進(jìn)行了水稻的遺傳轉(zhuǎn)化，并對轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行了初步的功能分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

材料為超級稻(Oryza sativa L.ssp.Indica)兩優(yōu)培九母本培矮64S(種子由湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供)和父本9311(種子由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院徐孟亮研究員提供)。

1.2 試劑

DNA Polymerase(TaKaRa LA Taq)、克隆載體 pMD18-T連接試劑盒、限制性內(nèi)切酶購于寶生物工程(大連)有限公司，dNTP、DNALadder Marker購于天根生化科技(北京)有限公司，PCR引物由Invitrogen公司合成，其他試劑均為分析純。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10B為本實驗室制備并于-80℃保存。

1.3 試驗處理與取材

種子用0.1%HgCl2消毒10 min，自來水沖洗3遍，25℃浸種3 d，每天換水1次，37℃催芽2 d-3 d，分批播于中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所網(wǎng)室盆中，當(dāng)秧苗生長至5葉期時，一部分作為苗期實驗材料；另一部分移栽至其他盆中，每盆栽5株，繼續(xù)置網(wǎng)室自然條件下生長發(fā)育，常規(guī)水肥管理與病蟲防治，作為孕穗期與抽穗開花期的實驗材料。

干旱脅迫處理：倒去盆中水層，置旱棚逐干，當(dāng)葉片開始卷曲16 h后取材，對照也置旱棚，但盆中保持水層。高溫脅迫處理：將盆中泥水溫調(diào)至45℃，置于美國Percival公司生產(chǎn)的PGC1515人工氣候箱中用45℃處理2 h后取材；對照置于另一PGC1515人工氣候箱中，溫度為28℃。處理與對照均為黑暗條件。低溫脅迫處理：將材料置于PGC1515人工氣候箱中，苗期4℃處理12 h后取材，孕穗期與抽穗開花期12℃處理16 h后取材，對照置于另一PGC1515人工氣候箱中，溫度為28℃。處理與對照均為黑暗條件。

每個處理與對照材料取4-5片倒二葉、4-5個未抽出的幼穗或已抽出的開花穗中部，剪碎，用液氮磨成干粉狀，立即分裝入5-6個事先裝有1.0 ml TRIzol提取液(Invitrogen)的1.5 ml離心管中，每管中約裝100 mg粉狀樣品，編號，蓋緊，搖動，使樣品與TRIzol提取液充分混合，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA提取

采用TRIzol試劑提取法。將-80℃保存?zhèn)溆玫臉悠啡〕?，解凍后，?00μL氯仿，振蕩混勻，4℃，12,000 rpm離心15 min，小心吸出上層水相，轉(zhuǎn)入另一離心管，加500μL異丙醇，沉淀、離心分離出RNA，再經(jīng)75%酒精洗滌，室溫微干后，加適當(dāng)體積的RNase-free水，充分溶解，測量RNA濃度。

1.5 基因芯片分析

按Affymetrix基因芯片系統(tǒng)中國經(jīng)銷商上海晶泰生物技術(shù)有限公司(GeneTech Biotechnology Limited Company)提供的Affymetrix表達(dá)芯片實驗操作手冊操作(2005年版)。主要步驟包括：①總RNA的提取和純化；②cDNA的合成和純化；③體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA和cRNA的純化；④cRNA片段化、配制雜交液；⑤芯片雜交；⑥洗脫芯片；⑦掃描芯片；⑧數(shù)據(jù)分析。

1.6 過量表達(dá)載體的構(gòu)建和水稻的遺傳轉(zhuǎn)化

從GenBank中搜索到OsMsr11的同源序列，應(yīng)用Vector NTI 11軟件分析設(shè)計該基因的PCR引物，上游引物5'端設(shè)有Sma I酶切位點，上游引物OsMsr11-F序列為：5'-CCCGGG GTGTGTTCTTCATCATCGCC-3'，下游引物OsMsr11-R序列為5'-CCTATAAGTGGGTTCGGTTC-3'，引物由Invitrogen合成，以培矮64SDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后在72℃下延伸10 min。擴(kuò)增、回收目的片段并連接到pMD18-T載體，篩選含有目的片段的陽性克隆，送Invitrogen公司測序。將測序正確的pMD18-T載體用SmaⅠ進(jìn)行單酶切后連入pCOsAc(來自pCAMBIA1301含有水稻ACTINI基因的啟動子和Nos終止子)，同時用pmacⅠ酶切表達(dá)載體PCOsAc質(zhì)粒并對切開的PCOsAc載體片段去磷酸化處理從而構(gòu)建成pCOsAc-OsMSR11表達(dá)載體。將構(gòu)建好的表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入超級稻父本9311愈傷組織中，通過共培養(yǎng)、潮霉素篩選獲得再生植株。

1.7 轉(zhuǎn)基因株系陽性鑒定

從水稻新鮮葉片中提取基因組DNA，根據(jù)表達(dá)載體上跨終止子序列設(shè)計引物，Primer-F:5′-GGTGTGTTCTTCATCAT CGCC-3′，Primer-R:5′-ATTCCCGATCTAGTAACATAGATGA CA-3′，PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s,60℃退火45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)35次；72℃后延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離。預(yù)期PCR產(chǎn)物片段長為662 bp。

1.8 轉(zhuǎn)基因株系的逆境處理

轉(zhuǎn)基因植株T1代種子耐鹽性實驗：將轉(zhuǎn)基因種子與9311野生型種子分別播放在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿10粒，重復(fù)3次。NaCl濃度分別0 mM，150 mM，每皿分別加10 ml，對照培養(yǎng)皿中加入10 ml水,培養(yǎng)在室溫條件下，3d后統(tǒng)計萌發(fā)情況（胚芽露出），統(tǒng)計后讓其繼續(xù)在原來的條件下生長12d，觀察生長情況并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

轉(zhuǎn)基因植株T1代種子ABA敏感性實驗：將轉(zhuǎn)基因種子與野生型對照種子分別在加有0μM、2μM、4μM、6μMABA的1/2 MS培養(yǎng)基中萌發(fā)(轉(zhuǎn)基因種子和野生型種子處于同一條件下，分別10粒)，重復(fù)3次，培養(yǎng)在溫室中，兩周后觀察生長情況。

2 結(jié)果分析

2.1 OsMsr11是一多逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因

為了發(fā)掘新的耐逆功能基因，采用Affymetrix基因芯片系統(tǒng)，分析了超級稻兩優(yōu)培九母本培矮64S(含51279個轉(zhuǎn)錄本)在苗期、孕穗期、抽穗開花期的葉片與穗在高溫、干旱、低溫逆境脅迫下的基因表達(dá)水平，篩選出一批顯著上調(diào)或下調(diào)的基因，OsMsr11是一個在低溫、干旱、高溫條件下均誘導(dǎo)表達(dá)的基因(圖1)。在低溫處理的幼穗中，表達(dá)水平上調(diào)幅度達(dá)126.2倍，在干旱條件下最高上調(diào)幅度為2倍，在高溫條件下最高上調(diào)幅度為11.27倍。相比之下此基因?qū)Φ蜏刈顬槊舾小?/p>

圖1 水稻培矮64S不同生育時期不同組織器官中OsMsr11基因在不同逆境與正常條件下的表達(dá)水平

2.2 OsMsr11基因的克隆與序列分析

為了進(jìn)一步研究OsMsr11在水稻耐逆過程中的作用，從GenBank中搜索到此基因在日本晴第8號染色體上的同源DNA序列（AP004460.2，19434-20130 bp之間），根據(jù)此同源序列設(shè)計基因特異性引物，因在日本晴第8號染色體上的同源基因沒有內(nèi)含子，本實驗用培矮64S基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含完整開放閱讀框架（open reading frame,ORF）的OsMsr11基因DNA片段（圖2），然后連接到pMD18-T載體上，測序后對其序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該DNA序列包含366個堿基（含有ORF），基因序列的ORF位于堿基48bp-282bp之間（圖3），其序列與GenBank中公布的日本晴基因組序列AP004460.2和超級雜交稻親本9311序列CM000133.1相對應(yīng)的堿基相比，不存在堿基差異。該基因與日本晴基因NM_001188461.1（NP_001175390蛋白）103bp-346bp之間的堿基序列同源性為91%，與高粱基因XM_002443838.1(XP_002443883蛋白)112bp-260bp之間堿基同源性為88%，與高粱基因XM_002443840.1(XP_002443885蛋白)100bp-298bp之間的堿基同源性為78%，與大豆基因BT092720.1(ACU17030蛋白)同源性為41.5%，與北美云杉基因EF081477.1(ABK20880蛋白)168bp-255bp之間的堿基序列同源性為72%。

圖2 OsMsr11 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

圖3 OsMsr11基因序列、推測的編碼蛋白序列及預(yù)測的啟動子區(qū)域順式作用元件

根據(jù)該基因所對應(yīng)的日本晴相應(yīng)基因組DNA序列(AP004460.2，Range:19539-19770)可能的啟動子區(qū)域(AP004460.2，Range:19500-18001)進(jìn)行在線PlantCARE軟件分析(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，在啟動子TATA-box上游，發(fā)現(xiàn)了5類與逆境相關(guān)的順式作用元件(圖3)，它們可能參與此基因?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)。

2.3 OsMsr11基因編碼蛋白質(zhì)序列及比對分析

采用Vector NTIAdvance 11.0軟件對此序列進(jìn)行分析，OsMsr11完整的ORF長度為234 bp，編碼77個氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測分子量為8.38 KD，pI約為8.79。蛋白質(zhì)相似性比對 (圖4)分析顯示，OsMsr11全長蛋白序列與秈稻9311第8號染色體上OsI_27861基因編碼的蛋白序列(EAZ05643.1，hypothetical protein)、日本晴第8號染色體上OsJ_26087基因編碼的蛋白序列(EAZ41563.1，hypothetical protein)完全一致。OsMsr11全長序列與Os08g0156033基因編碼的蛋白序列(BAH94118.1，Conserved hypothetical protein)相似性為 87%，與高粱第7號染色體上SORBIDRAFT_07g003730基因編碼的蛋白序列 (XP_002443883.1，hypothetical protein)相似性為69%。OsMsr11蛋白1-51間位氨基酸序列與高粱SORBIDRAFT_07g003745基因編碼的蛋白序列(XP_002443885.1，hypothetical protein)的6-56位間的相似性為75%，OsMsr11蛋白4-55位氨基酸序列與大豆ACU17030.1蛋白序列的3-54位間相似性為52%，4-77位氨基酸序列與北美云杉ABK20880.1蛋白序列的3-64位間的相似性為41%，4-50位氨基酸序列與葡萄XP_002274232.1蛋白序列的3-49位間相似性為55%，9-50位間氨基酸序列與蓖麻XP_002528939蛋白序列的8-49位間相似性為57%，4-53位氨基酸序列與擬南芥EFH43878.1蛋白序列的3-52位間相似性為48%。以上與OsMsr11基因編碼蛋白相似的預(yù)測蛋白全為功能未知蛋白。

圖4 OsMsr11編碼蛋白與其他類似蛋白的比對分析注：右側(cè)數(shù)字代表每行最后1個氨基酸的序號,進(jìn)行比對的植物蛋白質(zhì)包括BAG88611.1（OsMsr11）、NP_001061023.1、NP_001175390.1、XP_002443883.1、XP_002443885.1、ACU17030.1、ABK20880.1、XP_002274232.1、XP_002528939.1、XP_00286761?！?”代表高度保守的氨基酸殘基，“:”代表保守性極高的位點，“.”代表保守性稍低的殘基位點，“-”代表序列間無一致性位點。

利用ProtParam工具(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)分析OsMsr11蛋白的20種氨基酸中Ala所占比例最高，達(dá)到13%，而沒有Trp，此蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為36.05，脂肪指數(shù)為71.04，總平均親水性為-0.481，消光系數(shù)在280 nm處為5960，根據(jù)此工具分析說明此蛋白穩(wěn)定。使用ProtSca(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)對此蛋白序列進(jìn)行疏水性分析顯示：OsMsr11蛋白1-21位氨基酸之間為疏水區(qū)域，22-77位氨基酸之間為親水區(qū)域(圖5)，這與ProtParam中總平均親水性預(yù)測結(jié)果一致。利用SignalP3.0 server對OsMsr11 N端進(jìn)行信號肽預(yù)測表明此蛋白有信號肽序列，最可能的剪切位點在21-22之間，其功能蛋白為一親水性蛋白?；贖MM算法的預(yù)測結(jié)果可知，此蛋白存在信號肽的可能性為0.822，綜合NN算法和HMM兩種算法可知，OsMsr11基因編碼蛋白含有信號肽序列，此蛋白可能為分泌性蛋白，可能在信號識別中起作用。使用TargetP1.1對OsMsr11的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明可能是分泌通路信號肽，分泌到細(xì)胞周質(zhì)中，預(yù)測剪切位點的序列為21個氨基酸，與SignalP3.0 server預(yù)測結(jié)果一致。

2.4 轉(zhuǎn)OsMsr11基因水稻的鑒定與耐逆性分析

對獲得的再生植株用表達(dá)載體跨終止子特異性引物進(jìn)行PCR檢查，進(jìn)一步篩選轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果顯示有9株植株擴(kuò)增出662 bp的目的基因片段(圖6)，表明目的基因已成功整合到這些水稻的基因組中。

圖5 OsMsr11蛋白疏水性預(yù)測分析

為了分析過量表達(dá)OsMsr11是否改變轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性與對ABA的敏感性，從中篩選出3株進(jìn)行鹽脅迫處理與ABA敏感性實驗，結(jié)果均表現(xiàn)出不同程度的耐鹽性提高與對ABA敏感性的降低，其中H7株系最為明顯（圖7，8）。在正常條件下，轉(zhuǎn)基因和野生型植株的萌發(fā)率、莖長和根長沒有差異，在150 mMNaCl條件下，轉(zhuǎn)基因植株的萌發(fā)率、莖長和根長明顯高于野生型，且差異顯著(表1、2)。在對ABA敏感性的分析中，發(fā)現(xiàn)在0μM和2μMABA的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的莖長差異不顯著，在4μM和6μM ABA的培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因植株的莖長明顯高于野生型且差異顯著(圖8，表3)，上述獲得的結(jié)果表明：OsMsr11的過量表達(dá)提高了水稻的耐鹽能力，同時降低了對ABA的敏感性；OsMsr11基因的過量表達(dá)在水稻中可能是通過參與了不依賴ABA信號傳導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)對鹽的耐受力，可能編碼一個植物應(yīng)答ABA的信號傳導(dǎo)途徑中的一個負(fù)調(diào)控因子參與調(diào)控水稻幼苗莖的生長發(fā)育，具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究驗證。

圖6 PCR分析鑒定轉(zhuǎn)基因水稻植株

圖7 過量表達(dá)OsMsr11基因水稻和野生型水稻對鹽脅迫的耐受力

圖8 轉(zhuǎn)基因和野生型植株在不同ABA濃度下幼苗生長情況

表1 過量表達(dá)OsMsr11基因水稻在鹽脅迫下的萌發(fā)率統(tǒng)計

表2 過量表達(dá)OsMsr11基因水稻在150 mM NaCl脅迫下的根長、莖長統(tǒng)計

表3 過量表達(dá)OsMsr11基因水稻在不同ABA濃度下的莖長

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

OsMsr11基因是通過基因芯片技術(shù)篩選到的一個逆境條件下表達(dá)水平上調(diào)的基因。通過對該基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因無內(nèi)含子，啟動子區(qū)域含有5個逆境相關(guān)的順式作用元件；對蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)其親水性較強(qiáng)，無典型的保守結(jié)構(gòu)域，含有信號肽序列，預(yù)測其為分泌性蛋白質(zhì)。通過對轉(zhuǎn)基因水稻的耐逆性分析得出如下結(jié)論：

（1）OsMsr11基因是一個受逆境誘導(dǎo)的基因。

（2）水稻中過量表達(dá)OsMsr11基因降低了轉(zhuǎn)基因植株對外源ABA的敏感性。因此OsMsr11基因可能編碼一個應(yīng)答ABA信號傳導(dǎo)途徑中的負(fù)調(diào)控因子。

（3）水稻中過量表達(dá)OsMsr11基因提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。

3.2 討論

OsMsr11基因是一個受高溫、低溫、干旱誘導(dǎo)表達(dá)水平上調(diào)的基因。在低溫條件下，孕穗期穗和抽穗開花期的表達(dá)水平較高，特別是在低溫條件下孕穗期穗中的表達(dá)水平上調(diào)最為顯著，說明此基因?qū)Φ蜏乇容^敏感。另有報道證實OsMsr11基因在受亞砷酸鹽(AsIII)和砷酸鹽(AsV)脅迫時其表達(dá)水平也上調(diào)[11]，表明此基因有可能參與水稻對砷脅迫的響應(yīng)。OsMsr11基因編碼的蛋白質(zhì)親水性比較強(qiáng)，在逆境中可能具有一定的脫水保護(hù)劑的作用。Wise等[12]報道的LEA蛋白具有較高的親水性，在逆境條件下能夠保護(hù)細(xì)胞或膜結(jié)構(gòu)，恢復(fù)變性蛋白的活性等從而增加植物的耐逆性。植物參與耐逆性的功能基因大致可分為兩大類：一類是控制代謝酶或蛋白質(zhì)活性的效應(yīng)基因，它們直接參與代謝與生理變化過程，通過調(diào)節(jié)滲透勢，維護(hù)膜穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)構(gòu)象與穩(wěn)定，調(diào)節(jié)和加強(qiáng)植物自身代謝生理保護(hù)機(jī)制；另一類是調(diào)控其下游特異靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因[2]，它們間接影響代謝與生理過程，使植物獲得抵御脅迫的能力。OsMsr11基因編碼蛋白N端信號肽的預(yù)測表明此蛋白可能屬于分泌性蛋白質(zhì)，其可能是逆境相關(guān)基因的第一類即控制代謝酶或蛋白質(zhì)活性的效應(yīng)基因。這類基因調(diào)控合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的酶類基因，調(diào)節(jié)某些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，從而提高了植物的耐逆性，例如，P5CS1是控制脯氨酸合成的關(guān)鍵限速酶，在植物抗逆中發(fā)揮重要作用[13]。

真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，特別是轉(zhuǎn)錄因子直接與順式作用元件結(jié)合來調(diào)控靶基因，這種調(diào)控方式在逆境脅迫下基因表達(dá)調(diào)控中較為普遍[14]，植物基因啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了多種與逆境相關(guān)的順式作用元件，在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)控下游相應(yīng)基因的表達(dá)，從而使植物應(yīng)對不同的外界環(huán)境脅迫[15]。本研究在OsMsr11基因上游的可能啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了ABRE/G-box、ARE、CGTCA-motif、GARE-motif這 5 類順式作用元件，以往的研究證明這些順式作用元件以及與其相互作用的轉(zhuǎn)錄因子在ABA響應(yīng)及植物耐逆過程中發(fā)揮重要的作用[16]。在OsMsr11基因上游的順式作用元件中，其中3類是激素相關(guān)順式作用元件，表明它們可能與信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)，而激素信號傳導(dǎo)途徑與植物的耐逆性相關(guān)[17]，這些順式作用元件的存在進(jìn)一步說明其可能參與植物的耐逆響應(yīng)過程。

本研究對OsMsr11轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行了初步的功能分析，表明OsMsr11基因的過量表達(dá)降低了對外源ABA的敏感性，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性，說明OsMsr11可能編碼一個植物應(yīng)答ABA的信號傳導(dǎo)途徑中的一個負(fù)調(diào)控因子。但是大多數(shù)研究結(jié)果表明，對ABA高敏感的植物是通過調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉和ABA相關(guān)基因的表達(dá)從而提高植物對高鹽、干旱的耐受力[18]。Jung等[19]報道AtMYB44基因的過量表達(dá)增加了擬南芥植株對ABA的敏感性，降低葉片失水率，明顯增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性和耐鹽性；Xu等[8]報道的OsMsr2基因在擬南芥中過量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽、耐旱性，同時也增加了對外源ABA的敏感性。而本文報道的OsMsr11基因的過量表達(dá)降低了對ABA的敏感性，卻增加了對鹽的耐受力，這與以往大多數(shù)研究結(jié)果不同，但是也有與本文實驗結(jié)果類似的報道。Lee等[7]發(fā)現(xiàn)擬南芥中過量表達(dá)胡椒CaAMP1基因能夠增加轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽、耐旱性，但同時降低了對ABA的敏感性。轉(zhuǎn)基因水稻中實驗結(jié)果顯示OsMsr11基因的過量表達(dá)提高耐逆性，這一過程有可能是通過一種未知的負(fù)調(diào)控機(jī)制來調(diào)控ABA抗逆信號途徑實現(xiàn)的，從而使轉(zhuǎn)基因水稻具有抗逆性。到目前為止有關(guān)此基因的功能研究在本文中為首次報道，更深入的耐逆性方面研究正在進(jìn)行中。參考文獻(xiàn)：

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