電噴霧離子阱質(zhì)譜檢測(cè)亮菌甲素琥珀酸單酯的負(fù)離子裂解途徑＊

陳琴華 ，朱 軍 ，李 鵬

(1．湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 十堰 442008; 2．湖北醫(yī)藥學(xué)院藥物分析與篩選研究所，湖北 十堰 442008)

亮菌甲素是一種香豆素類(lèi)化合物，是從假密環(huán)菌中提取的有效成分之一，臨床研究表明其具有降酶、退黃的作用，療效和安全性較好[1－2]。其在水中幾乎不溶，為滿足臨床用藥需求，常需加丙二醇、聚乙二醇、吐溫等增溶劑以提高溶解度。增溶劑的加入或使用不當(dāng)常會(huì)引起毒副作用，降低藥物的安全性。亮菌甲素琥珀酸單酯(ArAAE)是采用前藥的設(shè)計(jì)方法，用琥珀酸酐將其結(jié)構(gòu)中的羥甲基?；瞥社晁釂熙ィ蟠蟾纳屏似渌苄訹3]。高效液相色譜－質(zhì)譜法(HPLC－MS)是近年來(lái)迅速發(fā)展的一項(xiàng)在線分離和檢測(cè)的高靈敏度、高專屬性、快速簡(jiǎn)便的分析技術(shù)，適用于生物樣品的定性和定量分析，是藥物代謝物結(jié)構(gòu)分析最有效的測(cè)定方法之一，其定量分析方法絕大多數(shù)均選擇離子檢測(cè)，必須弄清楚被測(cè)化合物的裂解碎片[4－5]。先前為了探討ArAAE的結(jié)構(gòu)及其裂解途徑，在正離子模式下建立了ArAAE的質(zhì)譜裂解行為，并歸屬其主要特征碎片離子[2]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，ArAAE在負(fù)離子模式下測(cè)定其檢測(cè)限更好。因此，本試驗(yàn)在負(fù)離子模式下對(duì)ArAAE進(jìn)行質(zhì)譜研究，為進(jìn)一步研究ArAAE的體內(nèi)作用過(guò)程與結(jié)構(gòu)修飾提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 藥品與試劑

亮菌甲素琥珀酸單酯[ArAAE，化學(xué)名為4－(3－乙?；?－羥基 －2－氧代－2H－色烯－5－基)甲氧基－4－氧代丁酸，本實(shí)驗(yàn)室合成，批號(hào)為20090422，純度為99．6%]，化學(xué)結(jié)構(gòu)式(M1)如圖1;甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司);水由Milli－Q水純化系統(tǒng)制備。取適量樣品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0．5 mg/mL的待測(cè)溶液。

1．2 儀器與ESI-MSn分離條件

Agilent 1100型液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)，包括電噴霧離子化源(ESI)、LC/MS trap software 4．2工作站、Data Analysis version 2．2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，并配有直接進(jìn)樣用注射泵和250 μL進(jìn)樣器，具有軟電離和多級(jí)離子阱質(zhì)譜功能。

1．3 方法

負(fù)離子檢測(cè)，毛細(xì)管電壓4 500 V，霧化器壓力10 Psi，干燥器溫度350℃，干燥器流速5 L/min，碰撞氣為氦氣，檢測(cè)方式為MSn(n=1～4)全掃描質(zhì)譜，質(zhì)量掃描范圍m/z100～500，蠕動(dòng)注射泵直接進(jìn)樣，溶液流速300 μL/h。

2 結(jié)果與分析

2．1 ArAAE負(fù)離子模式下的ESI-MS和ESI-MS2質(zhì)譜特征

ArAAE的ESI－MS質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1，可見(jiàn)ArAAE在負(fù)離子檢測(cè)方式下易失去1個(gè)H－，形成準(zhǔn)分子離子m/z333[M－H]－，且豐度較大。這表明在負(fù)離子模式下，ArAAE準(zhǔn)分子離子ESIMS是以 [M－H]－存在且離子穩(wěn)定性較好。

進(jìn)一步對(duì)準(zhǔn)分子離子m/z333[M－H]－進(jìn)行二級(jí)掃描，ESI－MS2掃描質(zhì)譜圖質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2，出現(xiàn)m/z233碎片離子，其結(jié)構(gòu)為M2(圖2)。從圖1和圖2可以看出，兩個(gè)離子強(qiáng)度分別為3．4×107和 3×107，說(shuō)明 ESI－MS2豐度與 ESI－MS 的豐度相當(dāng)，提示可選用m/z333＞233作為監(jiān)測(cè)子離子進(jìn)行ArAAE定量測(cè)定。ArAAE的裂解途徑見(jiàn)圖3。

準(zhǔn)分子離子m/z333[M－H]－在離子肼里，以He作為碰撞氣進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，主要發(fā)生以下裂解途徑:準(zhǔn)分子離子m/z333[M－H]－從從酯鍵發(fā)生α裂解，產(chǎn)生一個(gè)豐度較高的碎片離子，即m/z233[M2]－碎片離子。

2．2 ArAAE的ESI-MS3和ESI-MS4質(zhì)譜特征

圖1 ArAAE的分子結(jié)構(gòu)式(M1)和ESI－MS質(zhì)譜圖

圖2

圖3

在多級(jí)質(zhì)譜分析中，對(duì)子離子譜影響最大的是碎裂振幅。如果碎裂振幅太高，母離子完全碎裂;如果碎裂振幅太低，母離子沒(méi)有碎裂或子離子碎片過(guò)少，不便對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。對(duì)選定的ESI－MS2母離子m/z233逐漸加大碎裂振幅，比較不同碎裂振幅的多級(jí)質(zhì)譜圖，選擇最佳的多級(jí)質(zhì)譜分析條件，得到包含ESI－MS2母離子在內(nèi)的結(jié)構(gòu)信息，其碎片離子見(jiàn)圖4A。主要產(chǎn)生m/z分別為 215，203，189，177，171，163，147 和 135 的 8 種豐度較大的碎片離子。進(jìn)一步對(duì)3種豐度較大的碎片離子m/z203，189和163進(jìn)行碎裂振幅，得出這3種ESI－MS4的質(zhì)譜圖分別見(jiàn)圖 4 B(m/z203)、4 C(m/z189)和 4 D(m/z163)，其裂解圖見(jiàn)圖 5，m/z203，189 和 163 分子結(jié)構(gòu)式分別為 M3、M4和 M5。M2主要有以下裂解途徑:1)，從m/z203 ESI－MS4質(zhì)譜圖可看出其主要裂解為2個(gè)碎片離子，即M2失去一分子甲酰基(CH2O)，產(chǎn)生碎片離子m/z203(M3)，M3可進(jìn)一步裂解而產(chǎn)生m/z161和135的碎片離子;2)，由m/z189質(zhì)譜圖可看出在He的碰撞下，產(chǎn)生了m/z171，159和147的3個(gè)主要碎片離子，從裂解途徑可推斷出是由M2失去一分子CO2，產(chǎn)生成m/z189(M4)的碎片離子，M4失去一分子H2O產(chǎn)生m/z171的碎片離子，失去一分子CH2O產(chǎn)生碎片離子m/z159，而失去一分子C2H2O而產(chǎn)生m/z147的碎片離子;3)M2失去一分子H2O形成m/z215的碎片離子，M2產(chǎn)生m/z163的碎片離子，進(jìn)一步失去一分子H2O產(chǎn)生m/z145的碎片離子。從以上分析結(jié)果可見(jiàn)，ArAAE的裂解碎片離子見(jiàn)表1所示。

3 討論

20世紀(jì)20年代，質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分析領(lǐng)域。到了20世紀(jì)80年代，隨著快原子轟擊(FAB)、電噴霧(ESI)和基質(zhì)輔助激光解析電離(MALD I)等軟電離技術(shù)的出現(xiàn)，質(zhì)譜的分析性能得到了極大提高，離子阱質(zhì)譜儀是目前較成熟的質(zhì)譜儀之一，其主要優(yōu)點(diǎn)是在一級(jí)質(zhì)譜(MS)條件下獲得很強(qiáng)的待測(cè)物準(zhǔn)分子離子峰，幾乎不產(chǎn)生碎片離子，并且可借MSn(n=2～10)對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行多級(jí)裂解，進(jìn)而獲得豐富的結(jié)構(gòu)信息[6－7]。

圖4 m/z 217(A)ESI－MS3質(zhì)譜圖和 m/z 203(B)、m/z 189(C)和 m/z 163(D)ESI－MS4質(zhì)譜圖

圖5 ArAAE的ESI－MS3和ESI－MS4裂解途徑

本研究中采用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI－MS)技術(shù)，對(duì)ArAAE進(jìn)行質(zhì)譜研究，并歸屬其主要特征碎片離子?？梢钥闯觯珹rAAE的ESI－MS和ESI－MS2均只有1種主要的碎片離子，表明其一級(jí)準(zhǔn)分子離子和二級(jí)碎片離子均較穩(wěn)定，可以用母離子m/z333的子離子m/z233來(lái)進(jìn)行藥材含量測(cè)定。比較發(fā)現(xiàn)，其靈敏度在負(fù)離子模式下S/N更高，故提示負(fù)離子模式更加適合ArAAE藥物代謝動(dòng)力學(xué)的測(cè)量。ESI－MS3主要有3種裂解方式，主要產(chǎn)生m/z203，189和163這3種碎片離子，對(duì)其進(jìn)行了 ESI－MS4測(cè)定，明確了其特征碎片離子的歸屬，為進(jìn)一步研究ArAAE體內(nèi)代謝過(guò)程與結(jié)構(gòu)修飾提供試驗(yàn)依據(jù)。

表1 ArAAE的分子離子和碎片離子

[1]王 萍，葉 峰，劉 映，等．亮菌甲素治療黃疸型肝炎臨床觀察[J]．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23(17):2 554 －2 555．

[2]陳琴華，李 鵬，李春鋼．亮菌甲素琥珀酸單酯的正離子電噴霧離子阱質(zhì)譜裂解途徑的研究[J]．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，28(5):566－568．

[3]陳琴華，Stefanie Weibig，羅尚文，等．HPLC－MS法同時(shí)測(cè)定5種抗癲癇藥的血藥濃度[J]．中國(guó)科學(xué):化學(xué)，2010，40(6):762－767．

[4]Chen QH，Luo SW，Zhang YL，et al．Development of a liquid chromatography－mass spectrometry method for the determination of ursolic acid in rat plasma and tissue:Application to the pharmacokinetic and tissue distribution study[J]．Anal Bioanal Chem，2011，399:2 877 － 2 884．

[5]李 鵬，李春鋼，朱 瑜，等．反相高效液相色譜法測(cè)定亮菌甲素琥珀酸單酯注射液含量[J]．醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，28(11):1 493－1 494．

[6]陳懷俠，沈少林，韓鳳梅，等．高效液相色譜－電噴霧離子阱串聯(lián)質(zhì)譜分析水蘇堿及其大鼠體內(nèi)代謝物[J]．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41(5):467－470．

[7]Ma SG，Zhu MS．Recent advances in applications of liquid chromatography－tandem mass spectrometry to the analysis of reactive drug metabolites[J]．Chem － Biol Inter，2009，179:25 － 37．