微波輔助技術(shù)在大分子蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

馬申嫣，范大明，趙建新，*，龐 珂，陳 衛(wèi)，張 灝

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.無錫華順民生食品有限公司，江蘇無錫214218）

微波輔助技術(shù)在大分子蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

馬申嫣1，范大明1，趙建新1，*，龐 珂2，陳 衛(wèi)1，張 灝1

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.無錫華順民生食品有限公司，江蘇無錫214218）

微波技術(shù)作為一種高效的物理方法，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，近年來已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。介紹了微波對(duì)蛋白質(zhì)的作用機(jī)制，并圍繞微波在蛋白質(zhì)研究過程中的生物化學(xué)分析、多肽制備、有機(jī)合成和酶催化反應(yīng)中的輔助應(yīng)用進(jìn)行了綜述，為該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

微波，蛋白質(zhì)，分析，制備

蛋白質(zhì)是生物體細(xì)胞的重要組成成分，在細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用；同時(shí)作為食品中重要的組成成分，具有不可取代的營(yíng)養(yǎng)特性，提供人體必需的氨基酸，顯著影響食品品質(zhì)[1]。蛋白質(zhì)如此多樣化的功能與其化學(xué)組成密切相關(guān)，作為一種大分子物質(zhì)，由不同氨基酸以肽鍵相連而成。大量研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，一些化學(xué)或物理方法可以將氨基酸的肽鍵斷開或連接，從而實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的分析與制備。目前，用于蛋白質(zhì)裂解的主要方法為化學(xué)法和酶法[4]，化學(xué)法簡(jiǎn)單廉價(jià)，但反應(yīng)條件劇烈，難以控制裂解程度，且容易產(chǎn)生有毒物質(zhì)；酶法反應(yīng)條件溫和，具有高效性、專一性，但是酶解效率相對(duì)較低，常規(guī)水浴酶解需要幾個(gè)小時(shí)，耗時(shí)費(fèi)力。微波輔助蛋白質(zhì)裂解技術(shù)作為一種物理方法，可以代替常規(guī)傳導(dǎo)加熱，大幅度提高蛋白質(zhì)的裂解效率，便于程序操作。同樣，常規(guī)加熱方法在蛋白質(zhì)的合成中也存在效率低、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。因此，微波具有廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)裂解和合成過程的優(yōu)勢(shì)。然而，由于微波與生物體的相互作用是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，微波對(duì)蛋白質(zhì)作用的機(jī)理還在不斷完善。鑒于上述背景，本文綜述了近年微波輔助大分子蛋白質(zhì)的最新研究，希望以此深化微波與蛋白質(zhì)相互作用的探討，推動(dòng)微波在蛋白質(zhì)裂解與合成過程的廣泛應(yīng)用。

1 微波對(duì)蛋白質(zhì)作用機(jī)理

目前，關(guān)于微波對(duì)蛋白質(zhì)作用的機(jī)理研究仍處于不斷完善階段。許多學(xué)者認(rèn)為在此過程中只存在熱效應(yīng)[5-6]，然而在作用過程中所出現(xiàn)的一些異?，F(xiàn)象是熱效應(yīng)所無法解釋的[7-8]，因此，又有學(xué)者推測(cè)微波還存在非熱效應(yīng)?，F(xiàn)階段，非熱效應(yīng)理論尚處于模型和爭(zhēng)論階段。近年來，已有不少學(xué)者證實(shí)微波具有非熱效應(yīng)[9-10]。

近年來，微波輔助蛋白質(zhì)的研究主要利用其熱效應(yīng)。在蛋白質(zhì)溶液體系中，水和蛋白質(zhì)都屬于電介質(zhì)，具有吸收微波的良好特性。這些分子以極性共價(jià)鍵結(jié)合，正、負(fù)電荷中心不重合而形成偶極，整個(gè)分子呈現(xiàn)電荷的極性。在自由狀態(tài)下，它們雜亂無章地排列，正負(fù)電荷相互抵消，總體不顯電性。當(dāng)處于電磁場(chǎng)中時(shí)，這些相當(dāng)于一個(gè)個(gè)小磁針的極性分子就顯現(xiàn)呈方向排列的趨勢(shì)，當(dāng)電場(chǎng)方向改變時(shí)就會(huì)引起分子極的轉(zhuǎn)動(dòng)。電場(chǎng)頻率過大或過小都不會(huì)引起整個(gè)分子動(dòng)能的劇烈變化；但頻率處于兩種極端之間時(shí)，分子偶極既有重排的時(shí)間，又不能準(zhǔn)確應(yīng)激交流電場(chǎng)的變化，導(dǎo)致電場(chǎng)方向與偶極方向之間形成相位差，該相位差使得能量通過分子間的摩擦和碰撞被消耗，產(chǎn)生介電加熱，這就是微波熱效應(yīng)的原理[11]。極性分子高速“摩擦”產(chǎn)生的熱量不同于傳統(tǒng)的熱傳遞加熱方式，后者基于傳導(dǎo)、對(duì)流、輻射的方式將熱量由表及里傳入物料的內(nèi)部，加熱速度慢，加熱不均勻；而前者則采用內(nèi)外同時(shí)加熱的方式，加熱迅速且均勻。

關(guān)于微波對(duì)蛋白質(zhì)作用的機(jī)理，熱效應(yīng)理論認(rèn)為：水、蛋白質(zhì)等極性分子受到交變電場(chǎng)的作用而劇烈振蕩，相互“摩擦”產(chǎn)生熱量，從而導(dǎo)致溫度升高，使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的裂解與合成。

微波非熱效應(yīng)是指除熱效應(yīng)以外的其他效應(yīng)，如電效應(yīng)、磁效應(yīng)及化學(xué)效應(yīng)等，即在沒有明顯溫度變化的情況下，蛋白質(zhì)所發(fā)生的結(jié)構(gòu)和功能上的變化。大量實(shí)驗(yàn)表明微波能影響蛋白質(zhì)的折疊和展開，究其作用機(jī)理，不少研究人員認(rèn)為微波非熱效應(yīng)在此過程中具有不可替代的作用。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定功能，所以微波能通過改變蛋白質(zhì)構(gòu)象影響酶的催化活性，而且，微波與傳統(tǒng)加熱方法相比對(duì)酶活的影響存在顯著差異，很多文獻(xiàn)因此認(rèn)為這并不僅僅是由熱效應(yīng)引起的，微波加熱還具有非熱效應(yīng)。如Bohr H等[12]以β-乳球蛋白為研究對(duì)象，研究微波對(duì)球狀蛋白構(gòu)象的影響，發(fā)現(xiàn)在可逆變性階段，隨著溫度升高，蛋白質(zhì)展開的過程中，微波的加入促進(jìn)了蛋白質(zhì)的展開；隨著溫度的降低，蛋白質(zhì)折疊的過程中，微波的加入對(duì)蛋白質(zhì)的折疊過程同樣起到了促進(jìn)作用。由此，他們認(rèn)為微波促使蛋白質(zhì)折疊變性不僅僅是熵驅(qū)動(dòng)的，也是扭轉(zhuǎn)力和彎曲力競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果，也就是說微波對(duì)蛋白質(zhì)的影響存在非熱效應(yīng)。更有研究發(fā)現(xiàn)，微波的非熱效應(yīng)會(huì)使牛血清白蛋白形成類淀粉質(zhì)結(jié)構(gòu)[13]。Cara等[14]從酸熱芽孢桿菌（Bacillus acidoca ldarius）提取了嗜熱β-乳糖酶，并比較低能微波處理與傳統(tǒng)水浴加熱對(duì)不同濃度酶活的影響，證實(shí)在70℃條件下微波處理1h可以使?jié)舛葹?0～50μg/mL的嗜熱β-乳糖酶發(fā)生不可回復(fù)的失活，而70℃水浴加熱對(duì)酶活沒有影響；當(dāng)酶濃度為50～100μg/mL時(shí)，微波對(duì)酶活沒有影響。所以，微波對(duì)酶活性的影響并不僅僅是熱效應(yīng)，即使在沒有吸收大量熱的情況下也能改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象。

2 微波輔助蛋白質(zhì)研究

2.1 微波輔助蛋白質(zhì)生化分析

蛋白質(zhì)是細(xì)胞中含量最豐富的生物高分子有機(jī)物，在生化分析中，蛋白質(zhì)的分離和結(jié)構(gòu)解析占據(jù)很重要的位置，運(yùn)用質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的鑒定，最重要的一步就是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解。微波技術(shù)作為一種快速高效的加熱技術(shù)，可以用于此類處理過程，大幅縮短蛋白質(zhì)完全水解時(shí)間。

Lin等[2]對(duì)微波輔助胰蛋白酶催化反應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，在不同的有機(jī)溶劑中水解不同的蛋白質(zhì)（肌球素、細(xì)胞色素和溶解酵素等），甲醇濃度過高會(huì)使酶失活，而丙酮和氯仿不會(huì)影響酶的活性。但是，無論在哪種溶劑中，微波輔助水解的效率都高于常規(guī)方法，這是因?yàn)閭鲗?dǎo)加熱所需時(shí)間長(zhǎng)、升溫慢都會(huì)導(dǎo)致酶失活，而微波加熱可以在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到很高的溫度，在酶徹底失活之前完成水解。Juan[15]等用微波輔助內(nèi)切蛋白酶、胰蛋白酶將蛋白質(zhì)水解，經(jīng)處理的五種蛋白質(zhì)水解時(shí)間從常溫反應(yīng)的16h減少到了5min，然后進(jìn)行二維電泳和質(zhì)譜分析，結(jié)果表明微波方法優(yōu)于常規(guī)方法。同樣，在微波輔助酸水解過程中也得到了相似結(jié)論。Zhong等[16]用6mol/L HCl處理細(xì)胞色素C等蛋白質(zhì)，在微波輻射下水解30～90s，再用質(zhì)譜分析多肽鏈結(jié)構(gòu)，得到非常專一的多肽殘基峰位圖，沒有內(nèi)部干擾峰，表明微波輔助酸水解優(yōu)于常規(guī)方法。Lin[17]等在經(jīng)典酸水解反應(yīng)的基礎(chǔ)上，使用微波輔助快速水解蛋白質(zhì)技術(shù)，稀甲酸可以將蛋白質(zhì)水解成多肽，而且樣品不需要純化就可以進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，有效縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過程。

Marconi E[18]、崔蕊靜[19]、施文正[20]等也得到了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)了微波水解的高效性，但沒有進(jìn)一步研究微波水解與常規(guī)水解方法得到的氨基酸序列是否一致。Marconi E等[21]以牛血清蛋白為模型蛋白，將微波水解和傳統(tǒng)方法水解得到的氨基酸序列與理論值進(jìn)行比較，得出兩種水解方法的效果一致，作者還將這兩種水解方法應(yīng)用于乳酪和硬質(zhì)小麥兩種食品模型上，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性研究，結(jié)果同樣表明這兩種方法得到的水解產(chǎn)物種類、含量顯著相關(guān)。但是，Wu等[22]研究了弱酸環(huán)境中微波裂解肽鏈的情況，得出微波裂解肽鍵相對(duì)傳統(tǒng)方法具有快速、有選擇性的特點(diǎn)，且微波裂解的位置一般在天冬氨酸殘基的羧基和氨基末端。

2.2 微波輔助制備蛋白質(zhì)多肽

近年來，多肽的生理功能受到越來越多的重視。作為一種蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，多肽結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量小、易被機(jī)體吸收利用，以及功能性的高效表達(dá)，成為人體需要而且依靠外源攝入的活性物質(zhì)[23]。但是，功能性多肽多以聚合物（蛋白質(zhì)）的形式存在，分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，攝入人體后不易被靶向分解、消化吸收，從而影響了其生理功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的發(fā)揮。

目前，國(guó)內(nèi)外制備多肽的方法主要有：蛋白酶水解法、化學(xué)合成法、基因重組法和分離提取法等，其中酶法條件溫和，對(duì)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值破壞小，使得酶法成為生產(chǎn)功能性多肽的主要途徑[4]。但是，常規(guī)的酶解反應(yīng)需要在液相體系中進(jìn)行，耗時(shí)費(fèi)力。近年來，許多科研人員嘗試使用多種物理輔助手段縮短酶解時(shí)間，提高酶解效率。微波作為一種常用的物理輔助手段，廣泛應(yīng)用于多肽的制備。李菊芳等[24]以脫脂菜籽粕為原料，研究了堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步酶解菜籽粕制備菜籽多肽，得出利用微波輔助技術(shù)可以大幅提高酶解效率，高通量制備相對(duì)分子質(zhì)量在1000u左右的短肽。李利軍等[25]以家蠶廢絲為原料，建立并優(yōu)化絲素肽的微波輔助酸水解工藝，得出微波輔助產(chǎn)品回收率比磷酸水解方法提高約15%，且節(jié)省4～5h的水解時(shí)間。由于微波輔助制備多肽具有快速、高效和無污染的特性，劉靜[26]、王巖[27]等也將其分別應(yīng)用于制備小分子大豆肽和混合蛋白肽，取得了顯著的效果。

除此之外，在化工領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外研究人員為了提高一些困難的多肽合成反應(yīng)效率，也嘗試將微波應(yīng)用于化工領(lǐng)域，輔助合成生物活性寡肽、多肽和相應(yīng)聚合物[28]。Tantry等[29]使用酰氯和耦合劑輔助合成多肽，比較了傳統(tǒng)化學(xué)合成法和微波輔助合成法的優(yōu)劣，結(jié)果表明，720W條件下，微波輔助合成多肽僅需30～45s，合成率高于90%；傳統(tǒng)熱處理每一步反應(yīng)均需要15～30min，較微波輔助合成法有明顯的劣勢(shì)。在無溶劑及催化劑的條件下，陶虎春等[30]以氨水為原料微波輔助濕法合成聚天冬酰胺，得出微波輔助合成產(chǎn)物的碳酸鈣阻垢性能優(yōu)良，與傳統(tǒng)加熱方法制備的產(chǎn)物性能相近，且微波工藝具有反應(yīng)速度快、產(chǎn)率高、節(jié)能和污染少等優(yōu)點(diǎn)。同樣，Marek等[31]研究了微波輔助D，L-天冬氨酸縮聚反應(yīng)，也得到了相似的結(jié)果。

總之，微波輔助化學(xué)合成多肽反應(yīng)，可以減少甚至杜絕化學(xué)催化劑的添加，實(shí)現(xiàn)提高反應(yīng)效率的同時(shí)，減少產(chǎn)品中的雜質(zhì)[32]。

2.3 微波輔助蛋白質(zhì)有機(jī)合成

微波作為一種新型的加熱方式已被廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成等領(lǐng)域。在過去30年，微波輔助合成的方法幾乎被應(yīng)用到所有類型的有機(jī)反應(yīng)中。與傳統(tǒng)加熱方式相比，微波可提高反應(yīng)得率或大幅縮短時(shí)間[33]，有時(shí)還表現(xiàn)出和常規(guī)加熱不同的選擇性[34]。Orliac等[3]在無溶劑的條件下，以酯化葵花蛋白為目標(biāo)物，對(duì)經(jīng)典酯化方法和微波酯化方法進(jìn)行了比較，得出經(jīng)典酯化方法用時(shí)4h，有84%的葵花蛋白發(fā)生了酯化，而微波酯化只需18min就有89%發(fā)生了酯化，并發(fā)現(xiàn)微波酯化得到的酯化蛋白水解程度小。盡管有關(guān)微波輔助蛋白質(zhì)有機(jī)合成的研究報(bào)道已屢見不鮮，但是相比于常規(guī)加熱，微波加速或改變蛋白質(zhì)有機(jī)合成的反應(yīng)機(jī)理并不明晰。目前認(rèn)為微波存在3種可能的效應(yīng)：微波熱效應(yīng)、特殊的微波熱效應(yīng)和微波非熱效應(yīng)。關(guān)于微波在蛋白質(zhì)合成中的作用，學(xué)術(shù)界普遍存在兩種觀點(diǎn)：一是微波非熱效應(yīng)，Guan等[35]使用微波改善大豆分離蛋白-糖接枝反應(yīng)，結(jié)果表明微波加速了反應(yīng)進(jìn)程，作者認(rèn)為這是由微波非熱效應(yīng)引起的，微波使大豆分離蛋白分子中的非共價(jià)鍵及二硫鍵斷開，亞基解聚，分子充分伸展，反應(yīng)活化能也相應(yīng)降低，從而提高了大豆分離蛋白-糖接枝反應(yīng)的速率；二是微波熱效應(yīng)，認(rèn)為微波輔助蛋白質(zhì)有機(jī)合成產(chǎn)生不同效果的原因是溫度控制不準(zhǔn)造成的。Shazman等[36]使用傳統(tǒng)加熱和微波輔助加熱方法，分別使三種葡萄糖-甘氨酸溶液發(fā)生美拉德反應(yīng)，以褐變程度為測(cè)量指標(biāo)，用在線分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種加熱方式下的產(chǎn)物褐變程度無顯著差異。Meissner和 Erbersdobler[37]以牛奶為研究對(duì)象，同樣使用傳統(tǒng)加熱法和微波輔助法使之形成美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，也得到了類似結(jié)論，因此認(rèn)為微波輔助蛋白質(zhì)化學(xué)合成不存在非熱效應(yīng)。

2.4 微波輔助酶催化反應(yīng)

1990年以來，微波被應(yīng)用于生物催化反應(yīng)尤其是非水相酶催化反應(yīng)中。過度的微波處理會(huì)損傷酶的催化活性甚至使酶蛋白消解，但對(duì)大多數(shù)具體的酶促反應(yīng)而言，適當(dāng)?shù)奈⒉ㄌ幚砼c常規(guī)加熱相比具有明顯優(yōu)勢(shì)[38]，于是微波輔助酶催化技術(shù)開始被廣泛應(yīng)用。

蔡漢成等[39]以戊醇同分異構(gòu)體與n-辛醇為反應(yīng)底物，比較了常規(guī)加熱、在線微波處理和微波預(yù)處理酶三種模式下的非水相酶催化酯化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)微波輔助酶催化不僅加快了反應(yīng)速率2.5～4.5倍，同時(shí)也提高了反應(yīng)物得率。同時(shí)研究了微波輔助脂肪酶催化n-辛酸與n-丁醇酯化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)微波條件下，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征受到微波微弱的干擾，但并沒有從本質(zhì)上改變酶催化反應(yīng)的Ping-Pong Bi-Bi機(jī)制，只是在某一范圍內(nèi)使反應(yīng)偏離該機(jī)制。

Yadav等[40]研究了微波加熱和常規(guī)加熱脂肪酶Novozym 435催化乙酰乙酸甲酯和正丁醇的酯交換反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。分別固定一種底物和加酶量，考察兩種加熱模式下另一底物濃度變化對(duì)反應(yīng)初速度的影響，發(fā)現(xiàn)兩種加熱模式下反應(yīng)均遵循Ping-Pong Bi-Bi機(jī)制，即微波輻射并未改變酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)機(jī)制。在他們近期的另一研究[41]中，采用微波輔助酶催化合成二甘醇月桂酸酯，也得出了類似的結(jié)論，而且他們還發(fā)現(xiàn)了反應(yīng)在低溫微波加熱下能順利進(jìn)行，合成速率比傳統(tǒng)方法快33%，當(dāng)反應(yīng)溫度超過60℃時(shí)，由于酶被破壞，反應(yīng)速度急劇下降。

微波輔助酶催化在化工合成領(lǐng)域已顯示出了巨大的發(fā)展前景，但是有關(guān)它的研究仍處于實(shí)驗(yàn)積累階段，在機(jī)理等研究方面還不夠全面和深入，而且目前市售的大多數(shù)微波反應(yīng)器尚不能滿足微波輔助酶催化反應(yīng)精細(xì)的控溫要求，或相對(duì)于普通化學(xué)反應(yīng)而言較低的反應(yīng)溫度要求，因此，還需要進(jìn)一步的深入研究并且完善研究手段和方法。

3 結(jié)論

目前，微波由于其獨(dú)特的加熱性質(zhì)而受到越來越多的重視，在輔助蛋白質(zhì)研究過程中取得了一些成果，但相關(guān)機(jī)理研究尚不完善，需進(jìn)一步建立相應(yīng)模型，對(duì)微波影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)因素動(dòng)力學(xué)進(jìn)行深入研究，從而明確微波在輔助蛋白質(zhì)研究過程中的作用機(jī)制，完善知識(shí)體系，為進(jìn)一步的工業(yè)化推廣奠定基礎(chǔ)。

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Applications of microwave assisted technique in protein research

MA Shen-yan1，F(xiàn)AN Da-ming1，ZHAO Jian-xin1，*，PANG Ke2，CHEN Wei1，ZHANG Hao1
（1.National Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Wuxi Huashun Minsheng Food Co.Ltd.，Wuxi 214218，China）

As an efficient physical method，microwave has widely applied in many areas.Nowadays the microwave technique has become a focus both at home and abroad.The mechanisms of microwave interact on the protein wereaddressed.Furthermore，microwaveassistedproteinresearch，suchasproteomicanalysis，orientedhydrolysis，organic synthesis and enzyme coupling catalysis were discussed，so as to provide theoretical basis for the further research of this area.

microwave；protein；analysis；preparation

TS201.2+1

A

1002-0306（2012）05-0384-05

2011－04－20 *通訊聯(lián)系人

馬申嫣（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2008BAD91B03）；國(guó)家科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2008GB2B200083）。