豬繁殖與呼吸綜合征病毒反向遺傳技術(shù)的研究進(jìn)展

鄧雨修，王東東，潘永飛，周慶豐，蘇潤(rùn)環(huán)，李春梅

（廣東溫氏集團(tuán)研究院，廣東 新興 527400）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）誘發(fā)的急性接觸性傳染病，主要引起妊娠母豬的繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀。PRRS的病原具有遺傳多樣性，在世界上流行廣，防控難度大，所造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。豬繁殖與呼吸綜合征病毒屬于RNA病毒,利用反向遺傳學(xué)技術(shù)可以為其致病機(jī)制研究和新型疫苗的研制提供有效的技術(shù)平臺(tái)。以下主要從反向遺傳學(xué)技術(shù)在病毒基因功能研究中的應(yīng)用及減毒活疫苗株拯救等方面進(jìn)行闡述。

1 反向遺傳技術(shù)在PRRS病毒研究中的應(yīng)用

PRRSV作為正鏈RNA病毒家族的一員，其基因組同時(shí)也作為mRNA，并具有感染性。直接將編碼病毒基因組的cDNA克隆轉(zhuǎn)染，或?qū)Ⅲw外由cDNA克隆轉(zhuǎn)錄出的病毒RNA轉(zhuǎn)染易感細(xì)胞就可以獲得完整的有感染性的病毒。因此反向遺傳學(xué)在PRRSV的研究中應(yīng)用較廣，已滲透到了PRRSV研究的各個(gè)方面。

1.1 反向遺傳技術(shù)在PRRSV基因組結(jié)構(gòu)和功能研究中的應(yīng)用 隨著拯救技術(shù)的成熟，越來(lái)越多的研究者開(kāi)始利用反向遺傳技術(shù)通過(guò)缺失、突變等操作對(duì)PRRSV的基因功能進(jìn)行研究。Ansari IH等通過(guò)對(duì)GP5第34、44位和51位幾個(gè)糖基化位點(diǎn)進(jìn)行突變，然后拯救后發(fā)現(xiàn)，第44位突變后不能得到活病毒，而第34和51位突變后的拯救病毒滴度要低于母病毒。接種豬后發(fā)現(xiàn)，突變后的病毒可以產(chǎn)生較高的中和抗體。Han J等通過(guò)對(duì)nsp2進(jìn)行一系列的缺失操作后發(fā)現(xiàn)，nsp2的13～35位氨基酸是病毒復(fù)制的非必需區(qū)，高變區(qū)（324～813）可以承受100個(gè)或200個(gè)氨基酸的缺失，但是在324～726位不能全部缺失，最多容忍400個(gè)氨基酸的缺失。袁世山等對(duì)PRRSV的3′UTR進(jìn)行了一系列的缺失、插入后發(fā)現(xiàn)，UTR區(qū)的5′端可以承受41個(gè)核苷酸的缺失和23個(gè)核苷酸的插入，并且發(fā)現(xiàn)，此區(qū)域保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)微小的改變便會(huì)破壞病毒的感染性。

Zhou Lei等構(gòu)建了4個(gè)PRRSV全長(zhǎng)cDNA感染性克隆，然后拯救出的相應(yīng)毒株都能在MARC-145細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制，并且在SPF豬中檢測(cè)了上述拯救PRRSV的毒力，試驗(yàn)表明30位氨基酸的缺失對(duì)中國(guó)流行的高致病性PRRSV的毒力沒(méi)有影響。Kwon B等對(duì)FL12基因組的不同位置進(jìn)行了一系列突變，得到了不同的拯救病毒，發(fā)現(xiàn)nsp3～8以及ORF5上存在主要的潛在毒力位點(diǎn)；同時(shí)，nsp1～3、10～12以及ORF2上也可能有潛在的毒力位點(diǎn)。Chen Z等通過(guò)對(duì)nsp2上的B細(xì)胞表位進(jìn)行缺失操作，發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域?qū)τ赑RRSV的復(fù)制并不必要，但對(duì)于調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)有著重要的作用。Kim等利用反向遺傳技術(shù)通過(guò)插入與缺失nsp2區(qū)域的有關(guān)序列，重構(gòu)病毒，并對(duì)PRRSV的基因、氨基酸與其免疫原性和毒力的相互關(guān)系進(jìn)行了深入探索，說(shuō)明該技術(shù)在PRRSV中的應(yīng)用已經(jīng)達(dá)到了很高水平。

1.2 反向遺傳技術(shù)在PRRSV疫苗研究中的應(yīng)用 在研制PRRS減毒活疫苗方面，與傳統(tǒng)的連續(xù)細(xì)胞傳代弱化毒株的方法相比，反向遺傳技術(shù)可以很容易地根據(jù)不同的流行毒株而改變相對(duì)應(yīng)的保護(hù)性抗原，并且具有減毒途徑明確、效率高、毒力回復(fù)率低等優(yōu)點(diǎn)。Fang Y等通過(guò)將nsp2編碼區(qū)的編碼抗原決定簇ES4基因敲除，換以編碼綠色熒光蛋白（GFP）基因，得到了表達(dá)nsp2-GFP融合蛋白的PRRSV，動(dòng)物試驗(yàn)表明該重組病毒可以在血清學(xué)上和野毒株區(qū)分開(kāi)來(lái)，為以后標(biāo)記疫苗的研制提供了依據(jù)。Tan F等在N蛋白中發(fā)現(xiàn)了一些區(qū)域，這些區(qū)域的缺失并不影響PRRSV在細(xì)胞中的活力，這些區(qū)域還可以作為外源tag等插入，而成為標(biāo)記疫苗的候選。Lima M等通過(guò)去除特定的免疫顯性表位，得到了一系列毒株，進(jìn)一步為標(biāo)記疫苗的研制提供了證據(jù)。Wang Y等通過(guò)將強(qiáng)毒株MN184的結(jié)構(gòu)蛋白部分和弱毒疫苗Ingelvac PRRS MLV的非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行嵌合，將MN184進(jìn)行了致弱，提供了一種全新的、簡(jiǎn)便的制備弱毒疫苗的思路。Pei Y等利用PRRSV的TRS序列，在P129中插入了GFP和PCV2的衣殼蛋白基因，同樣都得到了表達(dá)，表明PRRSV亦可以作為疫苗載體應(yīng)用于豬疫病防治之中。

2 結(jié)語(yǔ)

反向遺傳學(xué)技術(shù)為研究PRRSV開(kāi)辟了新途徑，利用該技術(shù)可以了解病毒生命活動(dòng)過(guò)程中的各種調(diào)控機(jī)制,可以很容易地對(duì)病毒的復(fù)制及致病性分子機(jī)理進(jìn)行研究，從而開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的疫苗或藥物。反向遺傳操作技術(shù)最具潛力、最吸引人的應(yīng)用在于對(duì)新型疫苗株的篩選，其優(yōu)越性一方面在于可以解決疫苗研制的時(shí)效問(wèn)題，另一方面可以通過(guò)體外基因修飾的方式，將決定毒力的基因敲除，同時(shí)又可引入分子標(biāo)記以研制標(biāo)記疫苗。時(shí)至今日，PRRSV與宿主的相互作用、致病機(jī)制及基因變異與重組機(jī)制等仍是研究熱點(diǎn)。而反向遺傳技術(shù)作為一種十分有效的研究工具，由于其自身所固有的優(yōu)點(diǎn)，在未來(lái)的PRRSV研究中必將發(fā)揮出積極的作用。

參與文獻(xiàn)：

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