桿狀病毒表達(dá)載體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展

單士剛，包永芬，陳賢均

(咸寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧437100)

體外基因表達(dá)系統(tǒng)包括原核細(xì)胞系統(tǒng)和真核細(xì)胞系統(tǒng)。原核細(xì)胞系統(tǒng)主要是大腸桿菌細(xì)胞系。真核細(xì)胞系統(tǒng)包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)。其中昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，即桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(BEVS)，因其獨(dú)特的生物學(xué)特性，在過(guò)去的20年里，已作為一種真核表達(dá)載體被廣泛應(yīng)用。本研究就該系統(tǒng)的主要特性、種類以及在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用等方面進(jìn)行闡述。

1 桿狀病毒及其表達(dá)系統(tǒng)

桿狀病毒是一類專門(mén)寄生于節(jié)肢動(dòng)物的病原微生物。目前全世界已發(fā)現(xiàn)600多種桿狀病毒，其中研究最深入的是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)。AcNPV病毒粒子成桿狀，病毒囊膜直接包被著約130 kb的雙鏈、環(huán)狀DNA分子，其全基因組序列已經(jīng)測(cè)定清楚。20世紀(jì)80年代后期昆蟲(chóng)桿狀病毒已被成功開(kāi)發(fā)作為一種基因表達(dá)的載體，即昆蟲(chóng)桿狀病毒基因表達(dá)系統(tǒng)。目前其被廣泛應(yīng)用于外源目的基因的表達(dá)。由于利用真核的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)或昆蟲(chóng)細(xì)胞作為宿主，其表達(dá)的蛋白質(zhì)能夠進(jìn)行正確的轉(zhuǎn)錄后加工;桿狀病毒基因組本身較大且可操作性好，可以容納多個(gè)基因或較大的基因，而且桿狀病毒在自然條件下不能感染脊椎動(dòng)物，生物安全性好，這些優(yōu)點(diǎn)使桿狀病毒基因表達(dá)系統(tǒng)成為一項(xiàng)比較成熟、安全、經(jīng)濟(jì)、高效的蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)［1］。經(jīng)歷幾十年的發(fā)展，圍繞擴(kuò)大桿狀病毒表達(dá)體系的應(yīng)用范圍，科學(xué)家們對(duì)此體系進(jìn)行了一系列的改造。截止到目前，已有19種商品化的桿狀病毒表達(dá)體系得到廣泛應(yīng)用［2］。

2 桿狀病毒表達(dá)體系在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

2.1 作為基因治療載體 到目前為止人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)27種非人類病毒載體可用于臨床疾病的治療［3］，其中桿狀病毒是非復(fù)制型載體，且重組桿狀病毒載體具有容量大、易操作、易純化和安全性高的特點(diǎn)，因而是一種很有應(yīng)用前景的基因轉(zhuǎn)移載體［4］。自首次報(bào)道運(yùn)用桿狀病毒介導(dǎo)的p53基因治療骨肉瘤以來(lái)，已有許多利用桿狀病毒基因轉(zhuǎn)移技術(shù)進(jìn)行心血管、前列腺、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的治療研究。新近發(fā)現(xiàn)桿狀病毒還是潛在的、長(zhǎng)期的、高效的體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因載體。Pieroni等將桿狀病毒注射到不同鼠種的后四頭肌中時(shí)，報(bào)告基因得到了表達(dá)，一些鼠種的報(bào)告基因甚至表達(dá)了35～178 d。這使桿狀病毒在基因治療方面更具有應(yīng)用潛力。最近，有研究肯定了用含有白喉毒素基因的桿狀病毒對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的效果［5］;通過(guò)桿狀病毒介導(dǎo)在人胚胎干細(xì)胞內(nèi)也獲得了瞬間和穩(wěn)定的基因表達(dá)［6］，并且研究表明桿狀病毒能夠作為用于干細(xì)胞和骨組織工程中的新型基因轉(zhuǎn)移載體［7，8］。為了更好地發(fā)揮桿狀病毒在哺乳細(xì)胞中的作用，有學(xué)者對(duì)桿狀病毒載體進(jìn)行了改良。用含有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和綠色熒光報(bào)告基因(gfp)的病毒進(jìn)行有效的桿狀病毒介導(dǎo)性轉(zhuǎn)導(dǎo)，已在一系列細(xì)胞系和原代培養(yǎng)物中證實(shí);另一種能有效并穩(wěn)定地將重組基因?qū)爰?xì)胞的桿狀病毒載體也已報(bào)道。這種病毒含有1對(duì)表達(dá)盒(B-gal和潮霉素抗性)，并以來(lái)自腺病毒伴隨病毒(AAV)的倒置末端重復(fù)序列(ITR)為側(cè)翼［9］。

總之，重組桿狀病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)得到廣泛證實(shí)。桿狀病毒通過(guò)一種尚未闡明的侵入機(jī)制，使其成為一個(gè)能對(duì)許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行高效轉(zhuǎn)移的載體。但許多問(wèn)題，特別是體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其機(jī)制等需要進(jìn)一步研究和解決。

2.2 作為基因表達(dá)載體用于疫苗研制 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)由于其不具有任何對(duì)哺乳動(dòng)物有潛在致病性的動(dòng)物病毒片段，得到了人們的高度重視，被越來(lái)越多的應(yīng)用于多肽藥物和疫苗研制方面［10］。目前，桿狀病毒表達(dá)載體已用于多種疫苗的生產(chǎn)研制，主要集中于病毒和寄生蟲(chóng)疫苗，如HIV疫苗已于20世紀(jì)80年代進(jìn)入臨床，瘧疾疫苗已于20世紀(jì)90年代進(jìn)入臨床。與這兩種疫苗相比，針對(duì)細(xì)菌感染的基因工程疫苗則研究報(bào)道較少。相信隨著時(shí)間的推移，BVES系統(tǒng)用途會(huì)得到更大擴(kuò)展。

2.3 作為生物納米材料 近幾年來(lái)的研究致力于將生物學(xué)的工具用于納米科技領(lǐng)域，即將生物學(xué)應(yīng)用于納米科技，從而產(chǎn)生了生物納米技術(shù)。生物學(xué)材料可能是仿生納米級(jí)物體的獨(dú)特工具，有序的納米級(jí)生物分子是仿生無(wú)機(jī)納米結(jié)構(gòu)很好的模板。利用生物病毒開(kāi)發(fā)納米生物技術(shù)是近年引人注目、迅速發(fā)展的一個(gè)領(lǐng)域。桿狀病毒自身具有納米級(jí)結(jié)構(gòu)，因此成為生物納米技術(shù)領(lǐng)域中非常誘人的建筑材料。目前雖然有關(guān)利用昆蟲(chóng)桿狀病毒應(yīng)用于納米領(lǐng)域的報(bào)道還不多，但已出現(xiàn)一些新的研究動(dòng)向，如應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)SV40核衣殼蛋白，使之進(jìn)行自我組裝，成為一個(gè)能夠輸送生物活性物質(zhì)的納米膠囊［11］，有望應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域。利用桿狀病毒產(chǎn)生類似于犬細(xì)小病毒新的納米材料，應(yīng)用于腫瘤的治療［12］。

2.4 用于表達(dá)免疫活性分子和重組藥物蛋白 桿狀病毒表達(dá)載體自問(wèn)世以來(lái)，由于其不具任何對(duì)哺乳動(dòng)物有潛在的致病性的動(dòng)物病毒片段，表達(dá)的產(chǎn)物成本低、表達(dá)量高、構(gòu)象接近天然蛋白等特點(diǎn)，因此可用于免疫活性分子和重組藥物蛋白(如抗原、抗體、生長(zhǎng)因子、酶、干擾素等)的大量生產(chǎn)。自1983年首次表達(dá)IFN-β以來(lái)，已經(jīng)表達(dá)了(如生長(zhǎng)因子、酶、干擾素等)大量活性免疫分子和重組藥用蛋白，且具有廣泛的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。近來(lái)，Machado等［13］成功表達(dá)了漢坦病毒核蛋白，可用于血清學(xué)檢測(cè)。

2.5 用于基于細(xì)胞的藥物篩選 長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)乙肝病毒的研究由于缺乏一種合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)而受到限制，為此Delaney等［14］發(fā)展了一種新的體外表達(dá)系統(tǒng)。他們將具有復(fù)制性的HBV基因組重組至AcMNPV，用此重組AcMNPV介導(dǎo)HBV基因組進(jìn)入HepG2細(xì)胞系并使其得到高水平復(fù)制和表達(dá)，由此構(gòu)建HBV-AcMNPV-HepG2表達(dá)系統(tǒng)。并運(yùn)用此系統(tǒng)評(píng)價(jià)了抗病毒藥物拉米夫定對(duì)HBV復(fù)制及共價(jià)閉合環(huán)狀DNA聚集的影響。隨后Delaney等［15］又將HBV耐藥株重組至AcMNPV，并用此重組病毒測(cè)試了HBV耐藥株對(duì)不同藥物的交叉耐藥性。Adelhamed等［16］報(bào)道采用HBV-桿狀病毒系統(tǒng)對(duì)拉米夫定和Clevudine的抗HBV效果進(jìn)行了比較。

總之，桿狀病毒表達(dá)載體具有基因容量大、操作性好、表達(dá)效率高、生物安全性好、靶向性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究中應(yīng)用越來(lái)越廣泛，對(duì)醫(yī)學(xué)研究具有重要指導(dǎo)意義。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，BEVS的研究必將更加深入、完善。

［1］Aucoin MG，Mena JA，Kamen AA.Bioprocessing of baculovirus vectors:a review［J］.Current Gene Therapy，2010，10(3):174-186.

［2］Lin SY，Chen GY，Hu YC.Recent patents on the baculovirus systems［J］.Recent Pat Biotechnol，2011，5(1):1-11.

［3］Danijela KL，Hoeben RC.Non-human viruses developed as therapeutic agent for use in humans［J］.Rev Med Virol，2011，21(4):227-239.

［4］Kost TA，Condreay JP，Ames RS.Baculovirus gene delivery:A flexible assay development tool［J］.Curr Gene Ther，2010，10(3):168-173.

［5］Wang CY，Li F，Yang Y，et al.Recombinant baculovirus containing the diphtheria toxin A gene for malignant glioma therapy［J］.Cancer Res，2006，66(11):5798-5806.

［6］Zeng J，Du J，Zhao Y，et al.Baculoviral vector—mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells［J］.Stem Cells，2007，25(4):1055-1061.

［7］Chuang CK，Sung LY，Hwang SM，et al.Baculovirus as a new gene delivery vector for stem cell engineering and bone tissue engineering［J］.Gene Therapy，2007，14(19):1417-1424.

［8］Lin CY，Lu CH，Luo WY，et al.Baculovirus as a gene delivery vector for cartilage and bone tissue engineering［J］.Current Gene Therapy，2010，10(3):242-254.

［9］Lo WH，Hwang SM，Chuang CK，et al.Development of a hybrid baculoviral vector for sustained transgene expression［J］.Molecular Therapy，2009，17(4):658-666.

［10］Madhan S，Prabakaran M，Kwang J.Baculovirus as vaccine vectors［J］.Curr Gene Ther，2010，10(3):201-213.

［11］lnoue T，Kawano MA，Takahashi RU，et al.Engineering of SV40-based nano-capsules for delivery of heterologous proteins as fusions with the minor capsid proteins VP2/3［J］.J Biotechnol，2008，134(1-2):181-192.

［12］Singh P，Destito G，Schneemann A，et al.Canine parvovirus-like particles，a novel nanomaterial for tumor targeting［J］.J Nanobiotechnology，2006，4(2):1-11.

［13］Machado AM，Machado AR，Moreli ML，et al.Expression of recombinant Araraquara Hantavirus nucleoprotein in insect cells and its use as an antigen for immunodetection compared to the same antigen expressed in Escherichia coli［J］.Virol J，2011，8(218):1-8.

［14］Ddaney WV，Miller TG，Isom HC.Use of the hepatitis B virus recombinant baculovirus-HepG2 system to study the effects of(2)-b-29，39-didcoxy-39-thiacytidine on replication of hepatitis B virus an d accunmlation of covalently closed circular DNA［J］.Antimicmb Agents Chemother，1999，43(8):2017-2026.

［15］Delaney WE，Edwards R，Colledge D，et al.Cross-resistance testing of antihepadnaviral compounds using novel recombinant baculoviruses which encode drug-resistant strains of hepatitis B virus［J］.Antimicmb Agents Chemother，2001，45(6):1705-1713.

［16］Abdelhamed AM，Kelley CM，Miller TG，et al.Comparison of anti-hepatitis B virus activities of lamivudine and clevudine by a quantitative assay［J］.Antimicmb Agents Chemother，2003，47(1):324-336.