微透析取樣技術(shù)在中藥體內(nèi)分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展

季亞軍

中藥自身的特點(diǎn)決定了其體內(nèi)分布、代謝過程的特殊性與復(fù)雜性，因此，僅靠一種類型的分析技術(shù)并不能滿足中藥分析的要求，而需采用聯(lián)用多種分析技術(shù)進(jìn)行綜合分析。微透析(Microdialysis，MD)探針技術(shù)是近年來興起的生物活體取樣技術(shù)。它利用透析的原理，可在清醒、自由活動(dòng)的動(dòng)物身上進(jìn)行原位、實(shí)時(shí)、在線取樣［1］。近年來，微透析探針與色譜分析儀器聯(lián)用，為中藥體內(nèi)分析開辟了高效精確的新途徑。本文介紹微透析取樣技術(shù)的原理、組成、探針類型、特點(diǎn)以及在體微透析取樣技術(shù)在中藥體內(nèi)分析中的應(yīng)用，為藥學(xué)工作者提供中藥體內(nèi)分析方法的新思路。

1 微透析取樣技術(shù)的基本原理

微透析取樣技術(shù)的原理是將探針植入生物體內(nèi)，同時(shí)，開動(dòng)體外微量灌流泵，使灌流液流經(jīng)探針頭部的半透膜;可通過半透膜的小分子藥物順濃度差擴(kuò)散進(jìn)入透析管，并被透析管內(nèi)連續(xù)流動(dòng)的灌流液不斷帶出，灌流液和組織液中的待測藥物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，從而達(dá)到活體組織取樣的目的。

2 微透析取樣技術(shù)的組成

微透析裝置的組成并不復(fù)雜，主要包括探針、連接導(dǎo)管、微量灌流泵、灌流液、樣品收集器及定量分析儀器。微量灌流泵以注射泵為佳，可避免恒流泵和蠕動(dòng)泵的波動(dòng)，流速一般為1～5μL/min。灌流液應(yīng)選用細(xì)胞外液的等滲液，其中也會加入適宜的改性劑(如β-環(huán)糊精)，以提高探針的回收率［2］。探針是微透析裝置的核心部件，微透析的探針通常由一管式的再生纖維或聚碳酸酯透析膜固定于由鋼、石英毛細(xì)管或塑料制成的雙層套管構(gòu)成，其直徑一般為250～350μm。探針有多種形式，按其構(gòu)造大致可分為4類［3］:①主要用于腦部的同心圓式探針(Concentric cannula probe);②主要用于血管的柔性探針(Flexible probe);③主要用于肌肉、皮膚、腫瘤、肝等外周組織的線性探針(Linear probe);④主要用于膽管的分流探針(Shunt probe)。探針的類型、內(nèi)徑大小及切割分子量的大小可根據(jù)實(shí)際應(yīng)用的要求選定。

3 微透析取樣技術(shù)的特點(diǎn)

與傳統(tǒng)的在體分析方法比較，微透析取樣技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn):①連續(xù)性采樣:傳統(tǒng)在體分析方法中，樣品收集多采用侵入性的方式，此種方式受限于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如鼠)的體液量，若采樣過于密集，可導(dǎo)致動(dòng)物的低血容量;若取樣時(shí)間點(diǎn)不足，無法反映出藥物在體內(nèi)的連續(xù)變化過程，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)的客觀性。微透析技術(shù)的取樣量很小，不會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體液流失過多，又可連續(xù)性地收集樣品，可“實(shí)時(shí)”反映藥物在體內(nèi)的連續(xù)變化過程。②多部位采樣:可將微透析探針植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血管、肝臟、膽管、腦部等部位［4］，以擴(kuò)大體內(nèi)分析的范圍，獲取更多的藥物動(dòng)力學(xué)信息。此外，微透析探針還能植入腫瘤組織中，以檢測其中藥物濃度的變化［5］。③無需樣品前處理:傳統(tǒng)在體分析方法多需要樣品前處理，如蛋白質(zhì)沉淀、液液萃取等。而微透析取樣技術(shù)對分子量大小有一定的要求，因此，樣品相對干凈，除免去繁雜的處理步驟，還減少了樣品前處理帶來的人為誤差和雜質(zhì)對分析的干擾。④自動(dòng)篩選非結(jié)合型的游離態(tài)藥物:只有游離態(tài)的藥物才能到達(dá)細(xì)胞，并與其結(jié)合，產(chǎn)生進(jìn)一步的藥理作用。體內(nèi)分析的目的是檢測游離態(tài)藥物的濃度。傳統(tǒng)的在體分析方法通常無法將結(jié)合型與非結(jié)合型藥物分開，而結(jié)合型藥物通常無法透過微透析裝置中的半透膜。因此，微透析取樣技術(shù)得到的樣品皆為游離態(tài)藥物，而能更真實(shí)地反映藥物在體內(nèi)的藥理活性。

當(dāng)然，微透析取樣技術(shù)也有其局限性，一是微透析取樣是在非平衡條件下進(jìn)行的，所測得的透析液中，化合物濃度只是探針周圍樣品基質(zhì)中實(shí)際濃度的一部分，而非組織中的藥物濃度。雖然可用探針的回收率來修正測定值，但不夠完善，如脂溶性藥物會吸附在探針上，進(jìn)而影響回收率的測定［3］。二是微透析技術(shù)要求探頭必須準(zhǔn)確插在同一取樣部位，因此，不適合對很小的腦內(nèi)神經(jīng)核團(tuán)采樣。另外，由于微透析膜體積小，灌流液的流速低，想以“秒”為單位進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察較難實(shí)施。

4 微透析取樣技術(shù)在中藥體內(nèi)分析中的應(yīng)用

4.1 在腦內(nèi)分析中的應(yīng)用 微透析技術(shù)最初主要用于研究藥物在腦中的分布和轉(zhuǎn)運(yùn)［6］。一方面，由于微透析技術(shù)開發(fā)的目的是用于神經(jīng)化學(xué)方面的研究;另外，早期微透析探針的剛性設(shè)計(jì)只適于腦內(nèi)放置。用微透析取樣技術(shù)測定腦內(nèi)藥物濃度比其他測定方法有明顯的優(yōu)勢，如具有較好的時(shí)間和空間分辨性，選擇性好，且不受代謝物的干擾。利用微透析技術(shù)測定腦中中藥有效成分的含量或考察中藥的藥理作用的研究也早已開展。Tsai等［7］應(yīng)用微透析探針對黃芩素在海馬區(qū)中的藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，同時(shí)使用環(huán)孢霉素A考察P-糖蛋白對黃芩素代謝的影響。張群林等［8］應(yīng)用微透析-液相色譜-化學(xué)發(fā)光法測定大鼠腦組織中丹參酚類化合物的濃度，實(shí)現(xiàn)了腦組織中游離丹參素濃度的動(dòng)態(tài)監(jiān)測，具有高選擇性和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。呂允鳳等［9］應(yīng)用微透析技術(shù)和質(zhì)譜法測定川芎嗪對大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿釋放量的影響，方法學(xué)考察顯示，該法能夠準(zhǔn)確反映藥物對大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿釋放量的影響，與傳統(tǒng)方法相比，具有明顯優(yōu)勢。劉培等［10］應(yīng)用微透析結(jié)合HPLC-ECD快速測定正常和原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠下丘腦中的5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)含量。微透析樣品中5-HIAA的檢測限和定量限分別是1.5、5.0 ng/mL。痛經(jīng)模型大鼠的5-HIAA的含量比正常對照組顯著增加，表明原發(fā)性痛經(jīng)可導(dǎo)致5-HIAA增加。而經(jīng)過香附四物湯治療后，5-HIAA含量降低，顯示香附四物湯通過降低下丘腦的5-羥色胺的代謝率減輕原發(fā)性痛經(jīng)的疼痛綜合征。

4.2 在血液分析中的應(yīng)用 由于微透析取樣能收集不含蛋白質(zhì)的樣品，并能長期持續(xù)地從靜脈中取樣，所以倍受關(guān)注。汪晉［11］使用自制的微透析探針，結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)，檢測大鼠血液中游離態(tài)三七總皂苷的含量。方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，該法為在體、實(shí)時(shí)及持續(xù)檢測方法，可更為準(zhǔn)確地檢測體內(nèi)游離態(tài)藥物濃度。凌家俊等［12］采用微透析技術(shù)采血，應(yīng)用高效液相色譜法分析青藤堿在大鼠血液中的濃度，得出青藤堿在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程符合靜注二室模型，分布相和消除相的半衰期分別為10.98、44.71min，表明采用微透析技術(shù)檢測青藤堿血液濃度方法有效可行。也有研究者利用微透析技術(shù)測定川芎嗪在大鼠腦紋狀體及血液中的濃度。川芎嗪在兩部位的AUC值說明，其具有較高的血腦屏障滲透性，與川芎嗪可改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)相吻合［13］。王小坡等［14］在鬼臼毒素血液微透析樣品中加入依托泊苷(內(nèi)標(biāo))，經(jīng)乙酸乙酯液-液提取后，進(jìn)行UFLC-MS/MS測定。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該法的日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度均較小。結(jié)果表明，該法簡單可行。

4.3 在皮膚和皮下組織分析中的應(yīng)用 經(jīng)皮微透析(Cutaneous microdialysis，CMD)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)很多［15］，最大的優(yōu)點(diǎn)是可真實(shí)反映局部皮膚藥物濃度及代謝情況，并解決由于體外切除皮膚所遇到的水合、變性及細(xì)菌生長等問題。近年來，有關(guān)中藥及其制劑的CMD研究越來越多。鄧亞利等［16］采用微透析聯(lián)用HPLC的方法，研究青藤堿雷公藤甲素巴布劑裸鼠的在體透皮吸收過程，方法學(xué)驗(yàn)證表明，該法能夠在體、實(shí)時(shí)監(jiān)測裸鼠皮下青藤堿和雷公藤甲素的動(dòng)態(tài)濃度，為中藥透皮吸收的研究提供新的方法。凌家俊等［17］利用微透析技術(shù)研究不同工藝制備的青藤堿貼劑的生物等效性，以裸鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，經(jīng)皮給藥，采用微透析法測定青藤堿的體內(nèi)藥量。結(jié)果表明，青藤堿的脂質(zhì)體凝膠貼劑比普通凝膠貼劑具有更高的局部生物利用度，CMD技術(shù)可用于透皮貼劑的生物利用度及生物等效性研究。同年，該研究小組又以大鼠為研究對象，分別進(jìn)行經(jīng)皮及腹腔注射給藥，采用微透析技術(shù)取樣，高效液相色譜法分析，測定皮膚局部青藤堿濃度的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果證實(shí)，微透析取樣技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)皮膚局部藥物濃度的動(dòng)態(tài)測定，與傳統(tǒng)的皮膚藥物濃度測定方法相比，具有明顯優(yōu)勢［18］。王丹等［19］采用在體微透析取樣技術(shù)聯(lián)用RP-HPLC的方法，對大鼠皮膚中的葛根素進(jìn)行了體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)考察。方法學(xué)考察證實(shí)，此法能夠在體、實(shí)時(shí)監(jiān)測大鼠皮下葛根素濃度，方法快速、準(zhǔn)確、簡便，為葛根素經(jīng)皮給藥體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了理論基礎(chǔ)。

4.4 在其他組織中分析的應(yīng)用 Tsai等［20］利用微透析聯(lián)合HPLC，同時(shí)測定了小檗堿在大鼠血液、肝臟、膽汁中的濃度。藥時(shí)曲線表明，小檗堿iv給藥后20min，在肝臟和膽汁達(dá)到峰濃度，在膽汁的濃度明顯高于在血液和肝臟的濃度，提示小檗堿可能在膽汁中排泄。張英豐等［21］將微透析探針植入大鼠的右心室，實(shí)時(shí)、活體采集肌注鹽酸青藤堿后的透析液樣品，結(jié)果表明，鹽酸青藤堿肌注后，血藥濃度呈一級速率、一室模型，微透析法能較好地反映鹽酸青藤堿肌注給藥的藥動(dòng)學(xué)特征。

5 結(jié)語

目前，中藥藥效研究的核心是物質(zhì)基礎(chǔ)研究，而中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的體內(nèi)分析是實(shí)現(xiàn)這一核心的重要手段。微透析取樣技術(shù)具有高時(shí)間分辨性和選擇性的優(yōu)勢，在中藥藥效研究中具有廣闊的前景。然而，筆者認(rèn)為，在中藥的研究中普及微透析取樣技術(shù)亟需解決2個(gè)問題:一是微透析在中藥體內(nèi)分析中的重現(xiàn)性較差，在檢測濃度極低的同一種活性物質(zhì)時(shí)，結(jié)果有時(shí)相差近10倍［22］，仍需尋找完善的回收率測定方法;二是目前微透析裝置的核心部件(如微透析泵)均為國外進(jìn)口，價(jià)格昂貴，對實(shí)驗(yàn)普及不利，國內(nèi)自主微透析設(shè)備的開發(fā)勢在必行。

［1］Boddu SH，Gunda S，Earla R，et al.Ocular microdialysis:a continuous sampling technique to study pharmacokinetics and pharmacodynamics in the eye［J］.Bioanalysis，2010，2(3):487-507.

［2］Mathy FX，Lombry C，Verbeeck RK，et al.Study of the percutaneous penetration of flurbiprofen by cutaneous and subcutaneous microdialysis after iontophoretic delivery in rat［J］.J Pharm Sci，2005，94(1):144-152.

［3］Wei YH，Xu LZ，Shen Q，et al.Microdialysis:a technique for pharmacokinetic-pharmaco-dynamic studies ofoncological drugs［J］.Curr Pharm Biotechnol，2009，10(6):631-640.

［4］吳兆恩，王丹巧.多位點(diǎn)微透析技術(shù)在藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.中國中藥雜志，2010，35(13):1765-1768.

［5］Blakeley J，Portnow J.Microdialysis for assessing intratumoral drug disposition in brain cancers:a tool for rational drug development［J］.Expert Opin Drug Metab Toxicol，2010，6(12):1477-1491.

［6］Holmgaard R，Nielsen JB，Benfeldt E.Microdialysis sampling for investigations of bioavailability and bioequivalence of topically administered drugs:current state and future perspectives［J］.Skin Pharmacol Physiol，2010，23(5):225-243.

［7］Tsai TH，Liu SC，Tsai PL，et al.The effects of the cyclosporin A，a P-glycoprotein inhibitor，on the pharmacokinetics of baicalein in the rat:a microdialysis study［J］.Br J Pharmacol，2002，137(8):1314-1320.

［8］張群林，張?jiān)旗o，吳亮，等.微透析-液相色譜-化學(xué)發(fā)光法測定大鼠腦組織中丹參酚類化合物濃度及其藥代動(dòng)力學(xué)研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(9):1230-1237.

［9］呂允鳳，胡欣，畢開順.應(yīng)用微透析技術(shù)和質(zhì)譜法測定川芎嗪對大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿釋放量的影響［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43(11):1128-1133.

［10］劉培，段金廒，劉睿，等.微透析-HPLC-ECD聯(lián)用技術(shù)用于香附四物湯對大鼠腦內(nèi)5-HIAA動(dòng)態(tài)變化的評價(jià)［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(5):902-907.

［11］汪晉.三七總皂苷藥動(dòng)學(xué)及藥效評價(jià)新方法研究［D］.浙江:浙江大學(xué)，2010.

［12］凌家俊，王巖，謝波，等.利用血液微透析技術(shù)進(jìn)行青藤堿的藥動(dòng)學(xué)研究［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，22(5):405-407.

［13］Tsai TH，Liang C.Pharmacokinetics of tetramethylpyrazine in rat blood and brain using microdialysis［J］.Int J Pharm，2001，216(1-2):61-66.

［14］王小坡，曾抗，李國鋒，等.UFLC-MS/MS測定大鼠皮下及血液微透析樣品中鬼臼毒素濃度［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(6):1256-1259.

［15］夏愛曉，馮健，李范珠.微透析技術(shù)及其在經(jīng)皮給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2008，39(5):378-382.

［16］鄧亞利，周莉玲.微透析聯(lián)用高效液相色譜法研究青藤堿雷公藤甲素巴布劑的裸鼠在體透皮吸收過程［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(17):118-121.

［17］凌家俊，王巖，謝波，等.利用微透析技術(shù)進(jìn)行青藤堿貼劑的生物等效性研究［J］.中國中藥雜志，2008，33(21):2482-2485.

［18］凌家俊，謝波，王巖，等.利用微透析取樣技術(shù)實(shí)現(xiàn)皮膚局部青藤堿含量的動(dòng)態(tài)測定［J］.中藥材，2008，30(7):1062-1065.

［19］王丹，石力夫，胡晉紅，等.微透析聯(lián)用RP-HPLC對大鼠皮膚葛根素的藥代動(dòng)力學(xué)研究［C］.2008中國藥學(xué)會學(xué)術(shù)年會暨第八屆中國藥師周論文集［C］.2008.

［20］Tsai PL，Tsai TH.Simultaneous determination of berberine in rat blood，liver and bile using microdialysis coupled to highperformance liquid chromatography［J］.J Chromatogr A，2002，961(1):125-130.

［21］張英豐，王利勝，周莉玲.微透析法進(jìn)行鹽酸青藤堿肌注給藥的藥代動(dòng)力學(xué)研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(8):109-112.

［22］曹崗，邵玉藍(lán)，張?jiān)?，?微透析技術(shù)在藥動(dòng)學(xué)和藥物代謝研究中的應(yīng)用［J］.中草藥，2009，40(4):663-666.