小動物活體成像技術的應用進展

李 珂，趙 光綜述，高春芳，何偉華審校

動物活體內光學成像（optical in vivo imaging）主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術在活體動物體內進行生物標記，通過成像系統(tǒng)來監(jiān)測被標記動物體內分子及細胞等的發(fā)展進程，以及進行相關的生物、藥物治療研究[1-3]。

目前，國內、外實驗動物成像的主要手段包括結構成像（解剖成像）及功能成像 （分子成像）。以optical-imaging、micro-PET、micro-SPET為代表的動物功能成像技術不但能即時反映活體動物內的細胞分布及基因表達，還能動態(tài)觀察活體動物體內分子生物學過程，活體光學成像與micro-CT、MRI、ultrasound等結構成像手段結合，能為動物實驗提供更客觀的數(shù)據(jù)、更確切的分子生物特性。結合筆者所在醫(yī)院IVIS LuminaⅡ型活體成像設備 （living image）以及Living ImageSoftware分析軟件系統(tǒng)，對活體動物光學成像技術的應用進展綜述如下。

1 標記腫瘤及抗腫瘤藥物

1.1 活體腫瘤標記技術 GFP綠色熒光蛋白、β2半乳糖苷酶(LacZ)、螢火蟲熒光素酶（Luc）等是目前應用較廣的動物活體成像生物標記。GFP綠色熒光蛋白受藍、紫光照射可自發(fā)地發(fā)出綠色熒光，其信號強度高，易于被捕獲，且GFP不需底物，對組織、細胞均無毒副作用，故在腫瘤生長、藥效評價和基因治療等方面都得到了廣泛應用。GFP的缺點在于發(fā)射波長較短，穿透力稍差，對顯示深部腫瘤及微小病灶存在一定局限性。以LacZ、Luc標記的細胞較GFP更適合于深部組織腫瘤及遠處轉移微小病灶的研究?；铙w腫瘤標記途徑有細胞轉染原位移植術、腫瘤細胞株尾靜脈注射法、致癌化學制劑腹腔注射、呼吸道吸入等。閆明霞等[4]報道的綠色熒光蛋白標記的人肺癌皮下移植瘤模型主要通過慢病毒轉染法建立人肺癌NCI-H460-GFP細胞系，接種至裸小鼠體內建立皮下移植瘤模型，轉染率接近100%。李艷等[5]報道的活體動物乳腺癌模型是通過脂質體包裹帶有neo抗性基因及熒光素酶報告基因的真核表達質粒PGL4.17[luc2/neo]，體外轉染人乳腺癌細胞株MCF-7，將獲得穩(wěn)定表達熒光素酶的乳腺癌細胞株（MCF-7-luc）進行皮下接種BAB-c裸鼠及尾靜脈接種SCID小鼠，建立BAB-c裸鼠皮下移植瘤模型和SCID小鼠尾靜脈移植瘤模型。國內目前已建立有肺癌、乳腺癌、膀胱癌標記的活體動物模型，國外文獻報道還有肝癌、食管癌、胃癌等活體動物模型[6-9]。

1.2 標記抗腫瘤藥物 腫瘤早期，當運用解剖成像方法尚無法檢測到腫瘤病灶時，活體成像技術便可檢測到腫瘤發(fā)光信號，靈敏度較高。此外，解剖成像不能區(qū)分活細胞與凋亡細胞，活體成像技術可檢測到腫瘤活細胞信號，且不顯示已經凋亡的腫瘤細胞信號。在抗腫瘤藥物研究中，把標記過的抗腫瘤藥物運用在活體動物體內，給予已接種腫瘤的小鼠以不同治療方式、不同劑量、不同療程的抗腫瘤藥物。利用活體成像技術，在不同時間點動態(tài)觀察癌細胞在活體內的生物學變化特點，觀察抗腫瘤藥物的最佳治療方式、劑量、給藥時間等，也可標記腫瘤細胞，間接觀察阻斷RNA對腫瘤細胞的識別和殺傷。

2 標記、示蹤細胞

活體成像在標記、示蹤細胞方面運用了生物發(fā)光和熒光兩種技術。生物發(fā)光對標記少量細胞（5～300個/視野）較敏感，熒光對標記細胞數(shù)量大于300個/視野較敏感。美國文獻報道的利用生物發(fā)光技術檢測到細胞數(shù)量最少可至3個/視野[10]。示蹤細胞指在不同時間點對細胞存活狀態(tài)及分布走向進行觀察，有報道可示蹤的細胞包括造血干細胞、心肌干細胞、神經干細胞、CIK 細胞等[11，12]。

利用生物發(fā)光和熒光不但可以監(jiān)測到活體內細胞增殖，還可監(jiān)測凋亡細胞事件[13]，如熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式存在時無熒光素酶活性，于體內細胞不能發(fā)光，當細胞發(fā)生凋亡時，活化的caspase-3在特異識別位點切割去掉抑制蛋白，恢復熒光素酶活性就可產生發(fā)光。標記凋亡細胞可用于包括AIDS、神經退行性疾病、脊髓炎綜合征、缺血/再灌注損傷及腫瘤等細胞增殖-調亡的平衡被破壞而發(fā)生的一系列相關疾病的研究。

3 標記免疫排斥

標記免疫細胞的主要特點是觀察流體細胞在體內的動向和變化，常用于標記T細胞、NK細胞等，也可以標記干細胞及異體細胞，觀察干細胞演化和器官移植的研究。有報道，將熒光素酶標記的造血干細胞移植入脾及骨髓，可用于實時監(jiān)測活體動物體內干細胞造血過程的早期事件及動力學變化[14]。觀察免疫細胞對腫瘤細胞的識別、殺傷時可應用帶有生物發(fā)光標記的轉基因小鼠淋巴細胞，檢測放化療的效果，尋找抗腫瘤免疫治療中復雜的細胞機制。

4 標記細菌及病毒

利用細菌熒光素酶基因可以分別標記革蘭陽性和革蘭陰性細菌。用標記好的細菌侵染活體動物，觀測細菌在動物體內的繁殖部位、數(shù)量變化及對外界因素的反應，再通過活體動物成像技術對已標記細菌在活體內對藥物的反應進行觀察，并對比實驗數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)研究，篩選出藥物最佳劑量、給藥濃度及時間，還可觀察記錄藥物不同劑量對活體的毒副作用。其優(yōu)點主要有幾方面：①同一批老鼠持續(xù)觀察，避免個體間差異；②有更高的靈敏度，可以在感染早期就進行活體觀察；③可以有結構信息，在整體上觀察活體動物的感染途徑；④可定量，以比較各個器官的感染程度。在標記病毒方面，有報道用熒光素酶基因來標記HSV-1病毒，可觀察到HSV-1病毒對肝臟、肺、脾及淋巴結的侵入和病毒從血液系統(tǒng)進入神經系統(tǒng)的過程[15]。

5 標記基因及轉基因動物模型

活體成像技術可以從影響基因表達的各個不同的層面進行基因研究，可應用于某種疾病的基因表達、轉基因動物實驗以及基因治療等。在VEGFR2-Luc轉基因小鼠體內標記胚胎細胞[16，17]，在發(fā)育的過程可動態(tài)監(jiān)測到小鼠體內VEGFR2發(fā)光信號逐漸降低，至小鼠出生后VEGFR2表達的發(fā)光信號消失。同樣，研究者可根據(jù)研究方向，將靶基因、靶細胞、病毒及細菌進行熒光素酶標記后轉入動物體內，形成研究所需的各種小動物疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等。應用于基因治療方面，可將一個或多個感興趣的基因及其產物安全而有效的傳遞到體內靶細胞，再通過某種熒光素酶觀察目的基因是否在試驗動物體內持續(xù)的特異性表達或是抑制，基因治療也是包括腫瘤等多種疾病綜合治療的一個新熱點、新領域。

綜上所述，LuminaⅡ活體成像儀技術優(yōu)勢包括：高靈敏度的CCD制冷鏡頭，最低溫度可達-90℃到-105℃，即使體內發(fā)出很少的光子也能夠檢測到信號；自動曝光系統(tǒng)（auto exposure time）能自動檢測合適的曝光時間進行成像來獲得最佳信號；光譜分離技術能過濾背景熒光顯示標記熒光，可直接觀察活體動物體內的細胞凋亡；簡易的XGI－8氣體麻醉系統(tǒng)能使動物在成像過程中保持持續(xù)麻醉狀態(tài)，保證成像質量且避免麻醉過深導致的動物死亡。相對于其他非侵入性觀察手段，如Microsoft-PET、SPET，活體光學成像有靈敏度高、實驗成本低廉等特點，可以在短時間內應用盡可能少的動物數(shù)精確得到預期的實驗數(shù)據(jù)。

LuminaⅡ Living Image 4.0軟件分析系統(tǒng)，能無創(chuàng)的定量檢測小鼠原發(fā)瘤及轉移瘤，并對治療過程中腫瘤細胞的變化進行實時觀測和定量評估，文獻報道光學成像對于微小腫瘤轉移灶 （少到100多個細胞）既可檢測到發(fā)光信號，較micro-CT、MRI、ultrasound 等結構成像有更高的靈敏度[18]。 相對于傳統(tǒng)動物實驗技術，可以避免由于宰殺動物而造成的組間差異，可以節(jié)省動物的成本，可動態(tài)監(jiān)測腫瘤在體內的生長和轉移，使這些分子水平研究在更接近活體的環(huán)境中進行，把分子生物學體外研究方法在體內進行實現(xiàn)。傳統(tǒng)腫瘤研究的方法主要局限于肉眼觀察、處死動物后再進行的腫瘤體積測量、組織學切片觀察等，無法動態(tài)觀察整個腫瘤事件。

活體生物發(fā)光成像技術雖然是檢測實驗動物體內分子及細胞事件的強有力手段，但目前尚無法完成小分子藥物的標記，且分辨率、體內精確定位較差。所以，活體光學成像技術與結構成像技術結合來提高分辨率、體內精確定位等將是它的發(fā)展方向，也將為疾病在分子學水平的研究提供更廣闊的應用空間。

[1]Rosenthal EI，Kullbersh BD，King T，et al.Use of fluorescent labeled anti-epidermal growth factor receptor antibody to image head and neck squamouse cell carcinoma a xenografts[J].Mol Cancer Ther，2007，6(4):1231-1238.

[2]Garcia T，Jacksin A，Bachelier R，et al.A convenient clinically relevant model of human breast cancer bone matastasis[J].Clin Exp Metastasis，2008，25(1):33-42.

[3]Tavazoie SF，Alarcon C，Oskarsson T，et al.Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis[J].Nature，2008，451:147-152.

[4]閆明霞，劉 蕾，莢德水，等.人肺癌裸小鼠模型活體成像的動態(tài)觀察[J]. 腫瘤，2008，28（10）：833-836.

[5]李 艷，張海燕.通過活體動物光學成像系統(tǒng)建立乳腺癌動物模型[J]. 腫瘤，2009，29（1）：76-80.

[6]Podetz-Pedersen KM，Bell JB，Steele TW，et al.Gene expression in lung and liver after intravenous infusion of polyethylenimine complexes of Sleeping Beautytransposons[J].Human Gene Therapy，2010，21(2):210-220.

[7]Man K，Ng KT，Xu A，et al.Suppression of liver tumor growth and metastasis by adiponectin in nude mice throughinhibition of tumor angiogenesis and downregulation of Rho kinase/IFN-inducible protein 10/matrixmetalloproteinase 9 signaling[J].Clin Cancer Res，2010，16(3):967-977.

[8]Kazuyoshi Yanagihara，Misato Takigahira，F(xiàn)umitaka Takeshita，et al.A photon counting technique for quantitatively evaluating progression of peritoneal tumor dissemination[J].Cancer Res，2006，66(15):7532-7539.

[9]Takaomi Okawa，Carmen Z.Michaylira，Jiri Kalabis，et al.The functional interplay between EGFRoverexpression，hTERT activation，and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development，invasion，and differentiation[J].Gene&Development，2007，21(24):2788-2803.

[10]Daadi MM，Davis AS，Arac A，et al.Human neural stem cell grafts modify microglial response and enhance axonal sprouting in neonatal hypoxic-ischemic brain injury[J].Journal of Cerebral Circulation，2010，41(3):516-523.

[11]Gondi CS，Veeravalli KK，Gorantla B，et al.Human umbilical cord blood stem cells show PDGF-D-dependent glioma cell tropism in vitro and in vivo[J].Neuro Oncol，2010，12(5):453-465.

[12]Hata N，Shinojima N，Gumin J，et al.Platelet-derived growth factor BB mediates the tropism of human mesenchymal stem cells for malignant gliomas[J].Neurosurgery，2010，66(1):144-156.

[13]Bharathi Laxman，Daniel E.Hall，Mahaveer Swaroop Bhojani，et al.Noninvasive real-time imaging of apoptosis[J].PNAS，2002，99(26):16551-16555.

[14]Alnawaz Rehemtulla，Neelam Taneja，Brian D.Ross bioluminescence detection of cells having stabilized p53 in response to a genotoxic event[J].Molecular Imaging，2004，3(1):63-68.

[15]Yu H，Liu ZT，Lv R，Zhang WQ.Antiviral activity of recornbinant cyanovirin-N against HSV-1[J].Virol Sin，2010，25(6):432-439.

[16]Cheng SJ，Lee CM，Kim EM，et al.Evaluation of therapeutic efficacy of a VEGFR2-blocking antibody using sodium-iodide symporter molecular imagine in a tumor xenograft model[J].Nucl Med Biol，2011，38(1):93-101.

[17]Yamanaka Y，Ralston A.Early embryonic cell fate dicisions in the mouse[J].Adv Exp Med Biol，2010，695（1）:1-13.

[18]Walther KA，Papke B，Sinn Mb，et al Precise measurement of protein interacting fractions with fluorescence lifetime imaging microscopy[J].Mol Biosyst，2011，10[Epub ahead of print].