產(chǎn)褐藻酸鹽裂解酶菌株Shewanella haliotis BP-1的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

溫順華，李 鋒，黃庶冰，廖 威，陳麗梅，黃庶識(shí)*

（1.昆明理工大學(xué) 生物工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650500；2.廣西科學(xué)院 生物物理實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；3.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；4.廣西大學(xué)，廣西 南寧 530004；5.廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)系，廣西 南寧 530226）

生物質(zhì)能源已被認(rèn)為是解決全球能源危機(jī)的最理想途徑之一。作為生物質(zhì)能源之一的燃料乙醇已在全球得到廣泛的使用，但目前使用的乙醇主要是利用含淀粉作物和含糖作物（如小麥、玉米、甘蔗等）作為原料，通過(guò)發(fā)酵取得[1-2]。將糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物用于生物乙醇的大規(guī)模生產(chǎn)，將會(huì)導(dǎo)致土地利用的擴(kuò)張以及糧食價(jià)格的上漲，燃料乙醇的生產(chǎn)成本逐級(jí)提高，如果進(jìn)一步發(fā)展乙醇生產(chǎn)，主要原料和土地供給空間客觀上無(wú)法支撐燃料乙醇的擴(kuò)張。因此農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄物（如玉米秸稈、木材等纖維素生物質(zhì)）用于生物乙醇的生產(chǎn)被認(rèn)為是解決能源危機(jī)的最可行策略[3-4]。但是，纖維素水解酶的系列開(kāi)發(fā)、五碳糖發(fā)酵技術(shù)工程的菌株開(kāi)發(fā)以及然纖維素結(jié)構(gòu)中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三者有效分離還存在重大技術(shù)瓶頸，成為妨礙纖維素酶法生物轉(zhuǎn)化技術(shù)實(shí)用化的主要障礙[5]。

海洋藻類用于第三代生物質(zhì)能源的生產(chǎn)具有比較優(yōu)勢(shì)[6]。與陸生植物相比，利用海洋藻類生產(chǎn)燃料乙醇在解決能源和環(huán)境問(wèn)題的同時(shí)不會(huì)占用耕地，海洋藻類的光合轉(zhuǎn)化率高，碳水化合物含量高，與陸生纖維素生物質(zhì)相比，藻類幾乎不含木質(zhì)素，纖維素含量低，容易進(jìn)行預(yù)處理[7-8]。美國(guó)能源部（DOE）的一份研究報(bào)告分析顯示，每公頃海域年產(chǎn)大型海藻為59t（干重），其最高乙醇理論產(chǎn)量為干重的0.254%，基于這些數(shù)據(jù)估算，每公頃海域年最大乙醇產(chǎn)量為19000L[9]。這一數(shù)值比甘蔗的乙醇產(chǎn)量高了2倍，比玉米的乙醇產(chǎn)量高5倍[10]。但海藻成分較為復(fù)雜，如大型褐藻海帶，其碳水化合物的主要成分為昆布多糖、海帶淀粉、褐藻膠等多糖以及甘露醇等單糖，工業(yè)微生物無(wú)法直接利用這些多糖成分以及甘露醇來(lái)生產(chǎn)燃料乙醇，因此在藻類燃料乙醇的生產(chǎn)過(guò)程中需通過(guò)物理，化學(xué)或生物降解等方法來(lái)將多糖降解為微生物可直接利用的單糖[11]。傳統(tǒng)的化學(xué)酸水解法降解海藻的多糖工藝，條件不易控制，并且裂解的產(chǎn)物分子量不均一，生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生大量的廢氣和廢液，會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染；利用從微生物中分離提取的多糖降解酶，對(duì)海藻多糖降解為微生物可發(fā)酵糖組分，是一種經(jīng)濟(jì)、有效、無(wú)污染的方法。將海藻中多糖成份用于燃料乙醇生產(chǎn)的另一技術(shù)手段是通過(guò)基因工程方法來(lái)構(gòu)建能夠直接利用褐藻膠等海藻多糖來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的基因工程菌，如2012年WARGACKI A J等[12]通過(guò)基因工程手段構(gòu)建了一個(gè)能夠直接利用褐藻膠生產(chǎn)乙醇的工程菌，能夠直接將大型海藻的褐藻膠以及其他組分轉(zhuǎn)化為乙醇，盡管如此，其技術(shù)仍然是基于褐藻膠裂解酶。

褐藻膠占褐藻總碳水化合物的50%左右，是細(xì)胞壁的主要組成成分和胞內(nèi)基質(zhì)的成分，是由單糖醛酸聚合的多糖，單糖主要有兩類型，即β-（1→4）D-甘露醛酸（M）與α-（1→4）L-古羅糖醛酸（G）[13-15]。海藻酸鹽裂解酶能夠通過(guò)β消去基制將褐藻膠水解成為甘露糖醛酸和古羅糖醛酸[16]。前期研究結(jié)果顯示，甘露糖醛酸和古羅糖醛酸可以被特定酵母利用并轉(zhuǎn)化為乙醇。因此，海藻酸鹽裂解酶在將褐藻膠水解成為微生物可發(fā)酵利用的單糖的同時(shí)，還能降低褐藻與水混合液的黏度，利于乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)。褐藻膠裂解酶現(xiàn)在主要用于制備海藻原生質(zhì)體，廣泛運(yùn)用于藻類的細(xì)胞工程、基因工程等領(lǐng)域[17-18]。此外褐藻膠裂解酶還被用于醫(yī)藥研究，其可用作藥物酶治療由銅綠假單胞菌感染造成的肺囊性纖維化癥，另外還被用于制備具生物活性的海藻寡糖，近年來(lái)的研究表明，褐藻膠降解產(chǎn)物具有降血脂、抗腫瘤等作用[19-22]。但是，至今未有將褐藻膠裂解酶用于海藻生物質(zhì)能源領(lǐng)域的相關(guān)報(bào)道。

在褐藻生物質(zhì)能源的前期研究中，從腐爛的馬尾藻中分離鑒定了一株產(chǎn)多種裂解酶的菌株Shewanella haliotis BP-1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株除了能夠產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶以外，還能夠產(chǎn)瓊脂酶和昆布多糖酶，薄層層析（TLC）結(jié)果表明該菌株分泌的海藻酸鈉裂解酶能夠?qū)⒑Ｔ逅徕c水解成為單糖。本文對(duì)菌株Shewanella haliotis BP-1的產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶條件進(jìn)行初步優(yōu)化，為后續(xù)的酶特性研究、海藻的糖化處理以及海藻水解醪液制取乙醇提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株

從腐爛的馬尾藻（采集自北海潿洲島）中分離純化得到的海藻酸鈉裂解酶產(chǎn)生菌，經(jīng)理化和分子生物學(xué)鑒定為Shewanella haliotis BP-1，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5g，K2HPO41.05g，KH2PO40.45g，NaCl 1g，MgSO4·7H2O 0.05g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001g，海藻酸鈉（阿拉丁，AR）0.5g，蒸餾水100mL，pH 7.0。種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基成分相同，固體培養(yǎng)基中加入1.5%（w/v）的瓊脂粉。

1.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

通過(guò)單因素試驗(yàn)來(lái)初步優(yōu)化菌株Shewanella haliotis BP-1的產(chǎn)酶條件，試驗(yàn)過(guò)程中，在對(duì)應(yīng)幾種培養(yǎng)條件不變的情況下，通過(guò)改變單一培養(yǎng)條件或單一發(fā)酵培養(yǎng)基組份含量來(lái)進(jìn)行。菌株Shewanella haliotis BP-1在液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇，劃線培養(yǎng)并挑單菌落接種于種子培養(yǎng)基，37℃、160r/min培養(yǎng)24h作為菌種。除特殊說(shuō)明外，基本培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，100mL三角瓶裝液量為50mL。按1%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h后，發(fā)酵液4℃，12000r/min離心5min，取上清為酶液，-20℃保存，用于酶活測(cè)定。

1.4 酶活測(cè)定方法

酶活檢測(cè)方法參照PREISS J等的[23]方法作適當(dāng)修改。取2mL 0.1%（w/v）的海藻酸鈉溶液（0.1mmol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液配制），加入0.5mL酶液，在37℃水浴30min后沸水浴5min。冷卻至室溫后測(cè)波長(zhǎng)235nm處的吸收值。在波長(zhǎng)235nm處光密度每分鐘增加0.001定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.5 蛋白含量測(cè)定

蛋白含量測(cè)定按Bradford方法[24]。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

溫度是影響菌株生長(zhǎng)代謝的重要環(huán)境因子，分別在25℃、28℃、35℃、37℃的條件下，對(duì)菌株BP-1在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)72h，檢測(cè)發(fā)酵液中海藻酸鹽裂解酶活力。結(jié)果（圖1）顯示，在28℃～35℃溫度范圍內(nèi)，菌株具有較高產(chǎn)酶能力，35℃產(chǎn)酶能力最大，當(dāng)培養(yǎng)溫度低于28℃或高于35℃時(shí)，菌株的產(chǎn)酶能力大幅降低。

圖1 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on alginate lyase production

2.2 初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

用氫氧化鉀調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值，對(duì)菌株BP-1發(fā)酵培養(yǎng)72h，檢測(cè)發(fā)酵液中酶活力。結(jié)果（圖2）表明，該菌株在pH7.5～8.0的范圍內(nèi)具有較高的產(chǎn)酶能力，最適產(chǎn)酶pH值為8.0，高于8.0該菌株產(chǎn)酶能力大幅下降。

圖2 初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of initial pH value on alginate lyase production

2.3 不同濃度碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)菌株Shewanella haliotis BP-1只有以海藻酸鈉為碳源時(shí)才能產(chǎn)生海藻酸鈉裂解酶，表明海藻酸鈉是該菌株產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶的誘導(dǎo)物，對(duì)酶的產(chǎn)生至關(guān)重要。以海藻酸鈉作為唯一碳源，使用不同海藻酸鈉濃度的培養(yǎng)基分別對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)72h。當(dāng)海藻酸鈉濃度為0.4%（w/v）時(shí)菌株的產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，濃度大于0.4%（w/v）時(shí)菌株的產(chǎn)酶能力呈下降趨勢(shì)（圖3）。

圖3 海藻酸鈉濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of the sodium alginate on alginate lyase production

2.4 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

分別用0.5%（w/v）的酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、硝酸鈉、氯化銨、硫酸銨作為氮源進(jìn)行菌株的發(fā)酵培養(yǎng)，考查不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響。當(dāng)以牛內(nèi)膏和酵母粉作為氮源時(shí)菌株不產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶，以硫酸銨作為氮源時(shí)菌的產(chǎn)酶能力最高（圖4A）。隨后以硫酸銨作為氮源，考查不同氮源濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4B。當(dāng)硫酸銨濃度為0.6%（w/v）時(shí)菌株產(chǎn)酶能力最大，因此以0.6%（w/v）的硫酸銨做為產(chǎn)酶的最適氮源濃度。

2.5 無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.5.1 NaCl對(duì)產(chǎn)酶的影響

由于該菌株篩選自海洋，對(duì)鹽度的依賴是海洋微生物的典型特征。推測(cè)NaCl濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響較大。采用含不同濃度NaCl的培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖5，NaCl濃度在1%～2%（w/v）的范圍內(nèi)菌株產(chǎn)酶能力較高，當(dāng)NaCl濃度為2%（w/v）時(shí)菌株的產(chǎn)酶能力最為理想，高于2%（w/v）時(shí)菌株的產(chǎn)酶能力急劇降低。

圖4 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on alginate lyase production

圖5 NaCl濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of the NaCl on alginate lyase production

2.5.2 Mg2+、Fe2+對(duì)產(chǎn)酶的影響

配制含不同濃度MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，研究不同Mg2+和Fe2+濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6A，在不含Mg2+的培養(yǎng)基中幾乎無(wú)海藻酸鈉裂解酶活性，而當(dāng)MgSO4·7H2O濃度為0.2%（w/v）時(shí)菌株的產(chǎn)酶能力最強(qiáng)。Fe2+濃度的試驗(yàn)（圖6B）表明，高濃度的Fe2+會(huì)抑制菌株的產(chǎn)酶能力，但當(dāng)FeSO4·7H2O為0.001%（w/v）時(shí)菌株具備最佳產(chǎn)酶能力。

2.6 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖6 Mg2+和Fe2+濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of Mg2+and Fe2+on alginate lyase production

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別按0.5%（v/v）、1%（v/v）、2%（v/v）、4%（v/v）、6%（v/v）、8%（v/v）的接種量接入菌種進(jìn)行發(fā)酵72h，結(jié)果見(jiàn)圖7，當(dāng)接種量為1%時(shí)產(chǎn)酶量最大，高于1%時(shí)，隨接種量的增加菌體產(chǎn)酶量明顯下降。因此最適的產(chǎn)酶接種量為1%。

圖7 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of inoculum on alginate lyase production

2.7 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

采用500mL三角瓶，分別裝入50mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL不同體積的培養(yǎng)基，接種菌株后培養(yǎng)72h，結(jié)果見(jiàn)圖8。隨著裝液量的增加，菌體的產(chǎn)酶量隨之增加，當(dāng)裝量超過(guò)200mL時(shí)繼續(xù)增大裝液量，菌體的產(chǎn)酶量會(huì)隨之下降，表明菌體的產(chǎn)酶量會(huì)受溶氧量的影響。裝量為200mL時(shí)菌體的產(chǎn)酶量最大，適于批量發(fā)酵。

2.8 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

搖床轉(zhuǎn)速與發(fā)酵液中的溶氧量有關(guān)，這里研究了不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖9，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200r/min時(shí)菌體的產(chǎn)酶量最大，轉(zhuǎn)速大于200r/min時(shí)菌株的產(chǎn)酶能力急劇降低，表明該菌株可能是兼性厭氧菌。

圖8 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of shaking flask volume on alginate lyase production

圖9 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of rotation speed on alginate lyase production

2.9 K+濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

以上述優(yōu)化后的條件改變K+濃度來(lái)對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見(jiàn)圖10。試驗(yàn)表明在3種K+濃度組合中，在1.05%（w/v）K2HPO4加上0.45%（w/v）KH2PO4的K+配方培養(yǎng)菌株時(shí)，菌株的產(chǎn)酶能力最強(qiáng)。因此產(chǎn)酶培養(yǎng)基的K+配方初步確定為1.05%（w/v）K2HPO4加0.45%（w/v）KH2PO4。

圖10 K+濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of K+on alginate lyase production

2.10 優(yōu)化后菌體的產(chǎn)酶曲線

根據(jù)上述研究確定了菌株Shewanella haliotis BP-1產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶的最佳產(chǎn)酶條件。最佳培養(yǎng)條件為：pH 8.0，溫度35℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，接種量1%（v/v），裝量為500mL三角瓶裝200mL。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為K2HPO41.05%，KH2PO40.45%，MgSO4·7H2O 0.2%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，硫酸銨0.6%，NaCl 2%，海藻酸鈉0.4%。在此條件下對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)120h，每12h取樣1次，測(cè)發(fā)酵液中酶活性，蛋白量和菌濃度，計(jì)算酶的比活力，結(jié)果見(jiàn)圖11。培養(yǎng)24h后培養(yǎng)基中酶活性達(dá)到較大值（28.1U/mL），隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液酶活性在培養(yǎng)48h后達(dá)到最大值30.4U/mL，隨后緩慢降低，但發(fā)酵液中的蛋白濃度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，而細(xì)菌培養(yǎng)24h后即達(dá)到穩(wěn)定期，36h后為衰退期。通過(guò)比活力計(jì)算發(fā)現(xiàn)在24h時(shí)酶的比活力最大為0.92U/μg。分析發(fā)酵液酶活性在24h至60h相對(duì)穩(wěn)定的原因是隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加培養(yǎng)基的pH值升高（實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)24h后培養(yǎng)基的pH值升高至8.5），從而使酶的穩(wěn)定性降低，部份酶失活，菌株為了保持生長(zhǎng)需要持續(xù)分泌海藻酸鹽裂解酶來(lái)將海藻酸鈉水解，因此這也可能是發(fā)酵液中蛋白濃度持續(xù)升高的原因，培養(yǎng)基中蛋白濃度升高的另一原因可能是菌體的死亡裂解導(dǎo)致的。

圖11 優(yōu)化后菌株BP-1的產(chǎn)酶曲線Fig.11 Time course of alginate lyase production by strain BP-1 after optimization

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶菌株Shewanella haliotis BP-1的產(chǎn)酶條件，優(yōu)化后菌株的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為K2HPO41.05%，KH2PO40.45%，MgSO4·7H2O 0.2%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，硫酸銨0.6%，NaCl 2%，海藻酸鈉0.4%。最佳培養(yǎng)條件為pH 8.0，溫度35℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，接種量1%（v/v），裝量為500mL三角瓶裝200mL。在產(chǎn)酶最適培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)條件下菌株Shewanella haliotis BP-1培養(yǎng)24h后即可達(dá)到隱定期，此時(shí)培養(yǎng)液中酶的比活力最高。隨后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中酶的活性變化不大，保持在30U/mL左右。由于該菌株可能為兼性厭氧菌，因此培養(yǎng)液中的溶氧量對(duì)菌株的產(chǎn)酶影響較大。嚴(yán)格控制培養(yǎng)液中溶氧量有助于進(jìn)一步提高菌株的產(chǎn)酶能力，提高發(fā)酵液中的酶量。另外，該菌株的產(chǎn)酶發(fā)酵周期短，這是該菌株產(chǎn)酶的優(yōu)勢(shì)，利于工業(yè)發(fā)酵，可極大的降低生產(chǎn)成本。同時(shí)查《Bergey’s manual of Systematic Bacteriology》（2nd）[25]和網(wǎng)站http://www.bacterio.cict.fr/s/shewanella.html發(fā)現(xiàn)該菌株也是Shewanella屬中第一個(gè)篩選得到的能產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶的菌株。

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