液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中伏馬菌素FB-1和FB-2及其水解代謝物

摘 要 建立了MAX混合陰離子固相萃取柱凈化高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中伏馬菌素FB1和FB2及其水解代謝產(chǎn)物HFB1和HFB2的方法。牛奶樣品經(jīng)水稀釋后，經(jīng)MAX柱直接凈化，甲醇洗脫得到FB1和FB2，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜負離子掃描測定，1%乙酸甲醇洗脫得到HFB1和HFB2，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜正離子掃描測定。結(jié)果表明，添加濃度為0.l～5.0

SymbolmA@ g/L，牛奶中FB1和FB2及其水解代謝產(chǎn)物的回收率為76.4％～92.3％；相對標準偏差（RSD，n＝5） 為5.9％～12.5％；方法檢出限（LOD） 均為0.03

SymbolmA@ g/L；定量限（LOQ） 均為0.1

SymbolmA@ g/L。本方法操作簡單，靈敏度、回收率和重復(fù)性均良好。

[KH*3/4D][HTH]關(guān)鍵詞 [HTSS]牛奶； 伏馬菌素； 水解代謝產(chǎn)物； 固相萃??； 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

[HT][HK]

[FQ（3２，X，DY－Ｗ][CD15] 20110711收稿；20111228接受

本文系浙江省分析測試基金（No.2007F70026）及2010年浙江省\"三農(nóng)五方\"科技協(xié)作計劃資助項目

* Email: qianmingrong@yahoo.com.cn.

[HT]

1 引 言

伏馬菌素（Fumonisin，F(xiàn)B）是一類主要由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素，其中FB1（C34H59O15N，圖1）和FB2（C34H59O14N，圖1）是污染食品和飼料的主要成分，也是FB誘發(fā)食道癌、肝癌、胃癌等疾病的主要原因。FB在農(nóng)產(chǎn)品中污染范圍較廣，在玉米\\[1，2\\]、

紅酒\\[3\\]、啤酒\\[4\\]、蘆筍\\[5\\]、牛奶\\[6\\]等中有不同程度的檢出。目前尚未有牛奶中FB限量的規(guī)定，歐盟規(guī)定嬰幼兒玉米制品中FB（含F(xiàn)B1和FB2）的限量為0.2 mg/kg\\[7\\]，但研究報道低濃度FB與其它毒素如黃曲霉毒素會產(chǎn)生協(xié)同毒害作用\\[8\\]。 FB水解失去碳骨架14和15位的 [TS（][HT5”SS] 圖1 FB1（R1＝OH）， FB2（R1＝H）的結(jié)構(gòu)式

Fig．1 The structure of fumonisin B1 （FB1） and FB2[HT][TS）]

[TS（][HT5”SS] 圖2 HFB1（R1＝OH）， HFB2（R1＝H）的結(jié)構(gòu)式

Fig．2 The structure of hydrolysed fumonisin B1 （HFB1） and HFB2[HT][TS）]丙三羧酸基團后生成脫丙三羧酸伏馬菌素 （Hydrolysed fumonisin B， HFB），HFB1和HFB2（結(jié)構(gòu)式見圖2）能抑制神經(jīng)鞘氨醇的合成\\[9\\]。Pagliuca等\\[10\\]測定了豬肝中的FB1和HFB1，Gazzotti等\\[11\\]測定了豬肝中的FB1， FB2， HFB1和HFB2。尚未見牛奶中FB和HFB同時測定的報道。牛奶消費群體廣、數(shù)量大，檢測其可能含有的FB及其水解代謝物的殘留量對評價牛奶安全和保障人體健康有重要意義。

測定農(nóng)產(chǎn)品或食品中低濃度的FB和HFB，要求方法具有較高靈敏度，前處理一般需要濃縮富集凈化。文獻報道的前處理技術(shù)有免疫柱凈化\\[6\\]， HLB\\[12\\]柱凈化、陽離子柱凈化\\[13\\]和陰離子柱凈化\\[5，14\\]，測定方法有酶聯(lián)免疫法、膠體金法\\[15，16\\]、經(jīng)鄰苯二甲醛和巰基乙醇衍生后高效液相色譜熒光測定法\\[10，13，14\\]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法\\[5，6，11，12\\]。本實驗基于牛奶（pH≈7）中FB1和FB2的羧基發(fā)生電離，主要以呈負離子形式存在，HFB1和HFB2以分子形式存在，故采用陰離子反相混合MAX柱子同時凈化FB1， FB2和其水解代謝產(chǎn)物，并運用高選擇性和高靈敏度的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。結(jié)果表明，F(xiàn)B1和FB2在串聯(lián)質(zhì)譜負離子反應(yīng)監(jiān)測模式下背景值低于正離子模式，HFB1和HFB2正離子模式下響應(yīng)值遠高于負離子模式，因此采用負正兩種電離模式分別測定伏馬菌素和水解代謝物。4種化合物的方法定量限達到 0.1

SymbolmA@ g/L，能滿足牛奶中FB1， FB2及其水解產(chǎn)物測定的需要。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜：TSQ Quantum配surveyor液相操作系統(tǒng)（美國Thermo Fisher scientific公司）；Synergi Hydro RP 色譜柱（150 mm×2.0 mm，3

SymbolmA@ m， 美國Phenomenex公司）；Sorvall Primo R高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Nanosep GHP超濾濃縮離心管（0.45

SymbolmA@ m，美國PALL公司）；HLB柱（200 mg，6 mL，美國Waters公司）；MAX柱（150 mg，6 mL，美國Waters公司）。甲醇（色譜純，美國Merck公司）；甲酸和乙酸（色譜純，美國Tedia公司）；標準品FB1（＞98%）和FB2（＞98%）購自德國Sigma公司。分別準確稱取5.00 mg FB1或FB2， 用甲醇溶解并定容至25 mL，配制成200 mg/L儲備液。

HFB1和HFB2的制備：取0.5 mL 200 mg/L的FB1或FB2甲醇溶液，加入10 mL 1 mol/L KOH溶液，70 ℃孵育1 h，冷卻至室溫，用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)至pH 4.5\\[10\\]。轉(zhuǎn)移溶液至已用5 mL甲醇和5 mL水依次活化的HLB柱，5 mL水洗后，抽干，5 mL甲醇洗脫，并用甲醇定容至5.0 mL，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜確定無FB1或FB2殘留。HFB1和HFB2的濃度分別為11.2和11.0 mg/L，溶液用于質(zhì)譜條件優(yōu)化和稀釋后用于添加回收實驗。

2.2 實驗方法

吸取10.0 mL 牛奶于50 mL離心管中，加入10 mL水稀釋，轉(zhuǎn)移至已用5 mL甲醇和5 mL水依次活化的MAX柱，5 mL水洗滌、5 mL甲醇洗脫并收集，再用5 mL 1%乙酸甲醇洗脫并收集，氮氣吹干后，分別加入200

SymbolmA@ L甲醇0.1%甲酸（75∶25，V/V）混合液，振蕩渦旋15 s后轉(zhuǎn)移至超濾濃縮離心管中，以1000 r/min離心3 min后，取濾液進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

用甲醇配制濃度為0.5和0.05 mg/L的FB1， FB2， HFB1和HFB2混合標準溶液。在空白牛奶中進行4個添加濃度水平的回收實驗，每個實驗平行5次：10.0 mL牛奶中分別添加0.5 mg/L混合標準溶液20和100

SymbolmA@ L，添加0.05 mg/L混合標準溶液20和100

SymbolmA@ L，靜置1 h后按照上述實驗方法進行測定。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱柱溫: 30 ℃; 進樣量：20

SymbolmA@ L；流動相：甲醇0.1%甲酸（75∶25，V/V）混合液，流速：0.2 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧負離子掃描，噴霧電壓：

Symbolm@@ 3000 V；正離子掃描，噴霧電壓：4000 V；毛細管溫度：350 ℃；碰撞氣氬氣：1.5×10

Symbolm@@ 3 torr（11.2×10

Symbolm@@ 6 Pa）。定量和定性離子對、碰撞能量等參數(shù)見表l。在此條件下，F(xiàn)B1和FB2保留時間分別為2.9和4.3 min。HFB1和HFB2保留時間分別為3.0和4.1 min。

 分 析 化 學(xué)第40卷

第5期錢鳴蓉等： 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中伏馬菌素FB1和FB2及其水解代謝物 

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件的選擇

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定伏馬菌素一般采用正離子模式\\[5，6，11，12\\]。本實驗采用“T”三通方式，分別在負正離子模式下對FB1， FB2及其水解代謝產(chǎn)物進行質(zhì)譜條件優(yōu)化，F(xiàn)B1和FB2濃度均為10 mg/L。正離子模式下，以甲醇0.1%甲酸溶液（50∶50， V/V）為流動相，F(xiàn)B的響應(yīng)約為1×107，\\[M＋H\\]＋通過丟失TCA（HOCOCH2 CH（COOH）CH2COOH）和H2O裂解產(chǎn)生碎片\\[M＋H－2TCA－H2O\\]＋， \\[M＋H

Symbolm@@ 2TCA－2H2O\\]＋， \\[M＋H－TCA－H2O\\]＋ \\[10\\]，F(xiàn)B1主要生成m/z 352， 334和528，F(xiàn)B2主要生成m/z 336， 318和512。負離子模式下，以甲醇水（50∶50， V/V）為流動相，F(xiàn)B1或FB2 的\\[M

Symbolm@@ H\\]

Symbolm@@ 響應(yīng)約為2×106，主要由TCA基團與骨架相連的羧基發(fā)生斷裂產(chǎn)生碎片離子\\[OCOCH2CH（COOH）CHCO\\]

Symbolm@@ 和\\[M－H－HOCOCH2CH（COOH）CHCO\\]

Symbolm@@ ，其中FB1裂解生成m/z 157和562，F(xiàn)B2裂解生成m/z 157和546。



本實驗在FB1和FB2添加濃度均為0.1

SymbolmA@ g/L的條件下，分別在正負電離模式下進行反應(yīng)離子監(jiān)測掃描，分別以響應(yīng)值最高和次高的離子對用于定量和定性分析，其中正離子模式下FB1的定量與定性離子對分別為m/z 722.4/334， 722.4/352，F(xiàn)B2的定量與定性離子對分別為m/z 706.4/318， 706.4/336。在正離子模式下，背景響應(yīng)值較高，雜質(zhì)易對低濃度FB1的定量產(chǎn)生干擾；在負離子模式下，背景響應(yīng)值遠低

[LM][HT5”SS][*4]表1 伏馬菌素FB1， FB2和脫丙三羧酸伏馬菌素HFB1， HFB2的質(zhì)譜條件參數(shù)

Table 1 LCMS/MS parameters for fumonisin B1， B2and hydrolysed fumonisin B1， B2

[HT6SS][BG（][BHDFG４，WK16，WK8*2。2，WK14，WK10W]名稱Name分子量

Molecular weight電離模式Mode定性與定量離子對

Ion pairs for quantification

and confirmation碰撞能量Collision energy（eV）

伏馬菌素 B1

Fumonisin B1721.4－720.4/157*

720.4/5623830

伏馬菌素 B2

Fumonisin B2705.4－704.4/157*704.4/54638

29

脫丙三羧酸伏馬菌素B1

Hydrolysed fumonisin B1405.3＋406.3/388*406.3/37015

14

脫丙三羧酸伏馬菌素B2

Hydrolysed fumonisin B2389.3＋390.3/336*390.3/35419

14[BHDFG3，WKZQ0W] *：表示用于定量分析的離子對（Ion pairs with asterisk are used for quantification）。[BG）W][HT][]

于待測物響應(yīng)值，無明顯雜質(zhì)峰，信噪比高（圖3A），因此本實驗選擇在負離子模式測定牛奶中FB1和FB2。

HFB1和HFB2在負離子模式下無明顯響應(yīng)，在正離子模式下反應(yīng)離子碎片由\\[M＋H\\]＋失去1、2或3個H2O生成。正離子模式下，0.1

SymbolmA@ g/L的添加回收的提取離子流色譜圖見圖3B。

[TS（][HT5”SS]圖3 牛奶中添加濃度為0.1

SymbolmA@ g/L，負離子模式下FB1和FB2的提取離子流色譜圖（A）， 正離子模式下HFB1和HFB2的提取離子流色譜圖（B）

Fig．3 Extraction ion chromatograms of FB1 and FB2 detected in negative mode （A）， HFB1 and HFB2 detected in positive mode （B） spiked at 0.1

SymbolmA@ g/L in milk[HT][TS）]

3.2 凈化條件與色譜條件的確定

實驗測定市場不同品牌的15個牛奶樣品，pH均約為7。FB1和FB2含有2個TCA，為酸性化合物，在牛奶樣品中主要以負離子形式存在；HFB1和HFB2不含有羧酸基團，主要以分子形式存在。將牛奶用水稀釋后上柱，F(xiàn)B與MAX交換柱上的陽離子基團結(jié)合，HFB通過反相作用保留于MAX柱上，水洗滌去除雜質(zhì)后，用甲醇洗脫HFB，酸化甲醇使FB成分子形態(tài)同時被洗脫。

酸性化合物FB1和FB2在水中電離，以甲醇水為流動相時，兩種FB在色譜柱上的峰形嚴重拖尾。在流動相中加酸可抑制FB的電離、改善峰形，但酸濃度過高會抑制FB在負離子模式下的離子化效率、降低靈敏度。本實驗分析了甲醇和水相比例為75∶25（V/V），水相中甲酸濃度為0.05%， 0.1%和0.2%時FB的響應(yīng)值和峰形，當甲酸濃度為0.1%時，峰形對稱且響應(yīng)值較高，背景值較低；含有甲酸的流動相有助于提高HFB在正離子模式下的質(zhì)子化電離效率。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)與線性范圍

用流動相稀釋一系列FB1， FB2， HFB1和HFB2的混合標準溶液，濃度分別為1， 5， 10， 20， 50和100

SymbolmA@ g/L。同時按照2.2節(jié)處理空白牛奶樣品配制相同濃度的基質(zhì)混合標準溶液。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，基質(zhì)標準曲線與溶劑標準曲線的斜率比值可以反應(yīng)基質(zhì)干擾作用強弱。由圖4可見，F(xiàn)B1， HFB1和HFB2有一定的基質(zhì)抑制效應(yīng)，斜率之比分別為0.84， 0.83和0.91，F(xiàn)B2無明顯基質(zhì)干擾作用，為使定量分析更準確，配制基質(zhì)標準溶液進行定量分析。

[TS（][HT5”SS]圖4 FB1（A）， FB2（B）， HFB1（C）和HFB2（D）在溶劑標（■）和牛奶基質(zhì)標（▲）中的濃度峰面積線性回歸曲線

Fig．4 Linear regression curves for FB1（A），F(xiàn)B2（B），HFB1（C） and HFB2（D） in solvent（■） and milk matrix（▲）[HT][TS）]

3.4 方法的回收率、精密度和靈敏度

在空白牛奶中添加含F(xiàn)B1， FB2， HFB1和HFB2的混合標準溶液，使其濃度分別為0.1， 0.5， 1.0和5.0

SymbolmA@ g/L，方法回收率和精密度見表2。

在實驗色譜質(zhì)譜條件下，分析平行操作5次、添加濃度為0.1

SymbolmA@ g/L的FB1， FB2， HFB1和HFB2的分子離子峰圖譜。分別以噪音信號的3倍和10倍計算方法的檢出限和定量限。FB1， FB2， HFB1和HFB2的方法檢出限（LOD）為0.03

SymbolmA@ g/L，定量限（LOQ）為0.1

SymbolmA@ g/L。

[KH*4D][HT5”SS][*4]表2 方法添加回收率和精密度（n＝5）

Table 2 Recovery and precision of method（n＝5）

[HT6SS][BG（][BHDFG4，WK7*2，WK12，WK*2，WK12，WK*2，WK12，WK*2，WK12W]添加水平

Fortification

level （

SymbolmA@ g/L）FB1回收率

Recovery （%）RSD

（%）FB2回收率

Recovery （%）RSD

（%）HFB1回收率

Recovery （%）RSD

（%）HFB2回收率

Recovery （%）RSD（%）

0.180.58.478.610.379.46.776.412.5

0.586.57.682.68.4 81.69.385.78.4

191.26.789.27.785.45.982.49.7

588.29.183.59.4 92.37.785.16.8

[BG）Ｗ][HT][]

3.5 實際樣品的檢測

隨機抽取市場上6個不同品牌牛奶15個樣本，測定FB1， FB2， HFB1和HFB2含量。在某品牌牛奶中檢出FB1，含量為（0.18±0.013）

SymbolmA@ g/L （n＝3），其它未有檢出。與文獻\\[6\\]檢測出的牛奶樣品中FB1平均濃度0.6

SymbolmA@ g/L相當。

本方法能滿足牛奶中伏馬菌素及其水解代謝物檢測的要求，為進一步分析牛奶中真菌毒素的污染水平和安全性評價奠定基礎(chǔ)。

References

1 Silva L J G， Lino C M， Pena A， Molto J C. Food Addit. Contam.， 2007， 24（4）: 381～390

2 Ren Y P， Zhang Y， Han S Y， Han Z， Wu Y N. Anal. Chim. Acta， 2011， 692（12）: 138～145

3 Mogensen J M， Larsen T O， Nielsen K F. J. Agric. Food Chem.， 2010， 58（8）: 4853～4857

4 RomeroGonzalez R， Vidal J L M， AguileraLuiz M M， Frenich A G. J. Agric. Food Chem.， 2009， 57（20）: 9385～9392

5 LIU ChengLan， XU WenNa， LIU FengMao， PAN CanPing， XU YanJun， JIANG ShuRen. Chinese J. Anal. Chem.，2005，33（11）： 1619～1622

劉承蘭， 許文娜， 劉豐茂， 潘燦平， 徐彥軍， 江樹人. 分析化學(xué)， 2005， 33（11）： 1619～1622

6 Gazzotti T， Lugoboni B， Zironi E， Barbarossa A， Serraino A， Pagliuca G. Food Control， 2009， 20（12）： 1171～1174

7 Commission of theEuropean Communities. Official Journal of the European Union， 2006， L364： 5～24

8 Gelderblom W C A， Marasas W F O， LebepeMazur S， Swanevelder S， Vessey C J， Hall P dela M. Toxicology， 2002， 171（23）： 161～173

9 Seiferlein M， Humpf H U， Voss K A， Sullards M C， Allegood J C， Wang E， Merrill AH Jr. Mol. Nutr. Food Res.， 2007， 51 （9）： 1120～1130

10 Pagliuca G， Zironi E， Ceccolini A， Matera R， Serrazanetti G P， Piva A. J. Chromatogr. B， 2005， 819（1）： 97～103

11 Gazzotti T， Zironi E， Lugoboni B， Barbarossa A， Piva A， Pagliuca G. Food Chem.， 2011， 125（4）： 1379～1384

12 Sorensen L K， Elbak T H. J. Chromatogr. B， 2005， 820（2）： 183～196

13 Lino C M， Silva L J G， Pena A L S， Silveira M I. Anal. Bioanal. Chem.， 2006， 384（5）： 1214～1220

14 De Girolamo A， Pereboomde Fauw D， Sizoo E， van Egmond H P， Gambacorta L， Bouten K， Stroka J， Visconti A， Solfrizzo M. World Mycotoxin J.， 2010， 3（2）： 135～146

15 Wang S， Quan Y， Lee N， Kennedy I R. J. Agric. Food Chem.， 2006， 54（7）： 2491～2495

16 Quan Y， Zhang Y， Wang S， Lee N， Kennedy I R. Anal. Chim. Acta， 2006， 580（1）： 1～8

Determination of Fumonisins B1， B2 and Their Hydrolysed Metabolites in

Bovine Milk by Liquid ChromatographyTandem Mass Spectrometry



QIAN MingRong*1， WU LiQin1， ZHANG Hu1， LIU Fei2， LI Rui1， CHEN ZhiMin1， FANG LiZhen1

1（Zhejiang Province Key Lab for Food Safety， Institute of Quality and Standard for Agroproducts，

Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; Hangzhou 310021， China）

2（ThermoFisher Scientific （Shanghai）， Shanghai 201206， China）



Abstract MAX column combined with high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry was used to determine fumonisins B1（FB1）， FB2 and their hydrolysed metabolites in bovine milk. After 10 mL milk was diluted with 10 mL water， it was directly transferred to MAX column for purification. FB1 and FB2 were eluted with methanol and detected with HPLCMS/MS in negative mode. The hydrolysed metabolites hydrolysed fumonisins B1（HFB1） and HFB2 were eluted with methanol containing 1% acetic acid and detected with HPLCMS/MS in positive mode. The recoveries for four compounds were 76.4%－92.3% at fortification levels of 0.1－5

SymbolmA@ g/L in bovine milk and relative standard deviation was in the range of 5.9%－12.5%. The LOD was 0.03

SymbolmA@ g/L and LOQ was 0.1

SymbolmA@ g/L for FB1， FB2 and their hydrolysed metabolites. This method is simple， sensitive， and repeatabilities with satisfied recoveries.

Keywords Milk; Fumonisins; Hydrolysed metabolites; Solid phase extraction; High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry

（Received 11 July 2011; accepted 28 December 2011）