呋喃唑酮代謝物單克隆抗體制備及酶聯(lián)免疫吸附分析方法

摘 要 本研究針對呋喃唑酮代謝物（AOZ），設(shè)計(jì)合成了系列半抗原，進(jìn)一步通過偶聯(lián)牛血清白蛋白（BSA）免疫Balb/c小鼠、細(xì)胞融合、篩選和亞克隆等過程成功獲得了源于新穎半抗原H3的具有高親和力（親和力常數(shù)6.68×1010 L/mol）和高特異性（與其它功能類似物交叉反應(yīng)小于0.1%）抗AOZ單克隆抗體。同時，基于設(shè)計(jì)合成的系列同/異源半抗原/包被抗原，考察了不同結(jié)構(gòu)包被原對ELISA方法靈敏度的影響。另外，采用最佳的特征結(jié)構(gòu)異源包被原H5OVA，建立了以對硝基苯甲醛（pNP）為衍生劑的AOZ間接競爭ELISA（icELISA）和直接競爭ELISA（dcELISA）檢測方法。結(jié)果表明：icELISA模式的AOZ檢測IC50為0.503

SymbolmA@ g/L，定量檢測線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.06～14.0

SymbolmA@ g/L，檢出限（IC10）達(dá)0.017

SymbolmA@ g/L；dcELISA模式的AOZ檢測IC50為1.19

SymbolmA@ g/L，定量檢測線性范圍為0.14～23.6

SymbolmA@ g/L，檢出限為0.056

SymbolmA@ g/L。兩種方法對AOZ的檢測靈敏度和定量線性范圍均達(dá)到相關(guān)檢測限量要求，可滿足不同需求的實(shí)際樣品檢測。

[KH*3/4D][HTH]關(guān)鍵詞 [HTSS]呋喃唑酮； 單克隆抗體； 酶聯(lián)免疫法； 異源包被

[HT][HK]

[FQ（3２，X，DY－Ｗ][CD15] 20110429收稿；20111130接受

本文系國家自然科學(xué)基金 （No.30901005）、廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目 （Nos.2009B011300005，2010A090200084，2011A0902000029）和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校長基金 （No.5100K08198）資助

* Email: ymsun@scau.edu.cn[HT]

1 引 言

呋喃唑酮是一種硝基呋喃類藥物，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)類和禽類養(yǎng)殖，其在體內(nèi)代謝快速，主要以代謝物3氨基2?。牵疲模粒豹＿蛲橥ˋOZ）形式存在，具有一定毒性、致畸性、致癌性，對人體健康與生態(tài)平衡具有潛在威脅\\[1，2\\]。因此，歐美等多國禁止其在動物生產(chǎn)中使用，我國農(nóng)業(yè)部自2002年規(guī)定動物源性食品中呋喃唑酮不得檢出\\[3\\]。

目前，對食品中硝基呋喃類藥物殘留檢測方法主要有HPLC， HPLCMS/MS等儀器法\\[4，5\\]，該類方法靈敏、準(zhǔn)確，但存在前處理繁瑣、操作復(fù)雜、檢測成本高的問題，難以滿足現(xiàn)場大批量樣品快速檢測要求。近年來，基于抗原抗體反應(yīng)的ELISA等快速免疫分析方法以其特異性強(qiáng)、靈敏、簡便、準(zhǔn)確和樣品通量高等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)儀器法的不足，成為農(nóng)獸藥殘留快速篩查的熱點(diǎn)技術(shù)方法\\[6～8\\]。Cooper等于2004年首次制備了呋喃唑酮代謝物的多克隆抗體，對蝦組織樣品中AOZ的檢出限為0.3

SymbolmA@ g/L\\[9\\] ；Liu等報(bào)道了多克隆抗體檢測ELISA方法， 檢出限為0.05～12.15

SymbolmA@ g/L\\[10\\]。多克隆抗體批間差異大，不利于開發(fā)性能穩(wěn)定的快速檢測產(chǎn)品，因而開發(fā)可彌補(bǔ)多克隆抗體不足的單克隆抗體已成為發(fā)展趨勢。Diblikova等在呋喃唑酮代謝物單克隆抗體基礎(chǔ)上建立了定量檢測范圍達(dá)到0.05～5

SymbolmA@ g/L的ELISA方法\\[11\\]。另外，由于AOZ分子太小，難以直接檢測，必須采用衍生化增加分子量方法實(shí)現(xiàn)間接檢測\\[9～11\\]。本研究以對硝基苯甲醛（pNP）為AOZ衍生試劑，基于新設(shè)計(jì)合成的系列半抗原，制備篩選獲得了高特異性、高親和力抗AOZ單克隆抗體，并在考察了不同結(jié)構(gòu)包被原對ELISA方法靈敏度的影響基礎(chǔ)上，采用最佳的特征結(jié)構(gòu)異源包被原，建立特異、靈敏、穩(wěn)定的AOZ間接競爭ELISA（icELISA）和直接競爭ELISA（dcELISA）檢測方法，為進(jìn)一步開發(fā)可滿足實(shí)際樣品不同檢測需求的直接和間接競爭ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

MK3多功能酶標(biāo)儀（Thermo公司）；HP1100液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent公司）；DRX600核磁共振儀（Bruker公司）；UV1640A紫外可見掃描儀（Kyoto公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（ShellLab）；6K15高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；XSB1A倒置顯微鏡（上海精密儀器有限公司）。

AOZ衍生物pNPAOZ（本實(shí)驗(yàn)室自制）；牛血清蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）、二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、N羥基琥珀酰亞胺（NHS）、弗氏完全、不完全佐劑、PEG4000、抗體亞類鑒定試劑盒（Sigma公司）；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體（博士德生物公司）；RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、HAT、HT（Gibco公司）；胎牛血清（四季青公司）；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室保存）；雌性Balb /c小鼠（6～8周齡，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心）。

 分 析 化 學(xué)第40卷

第5期任海濤等： 呋喃唑酮代謝物單克隆抗體制備及酶聯(lián)免疫吸附分析方法 

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 半抗原合成 半抗原合成路線如圖解1所示。半抗原H1或H4：1 mmol AOZ與乙醛酸（或羧基苯甲醛）于10 mL甲醇中室溫反應(yīng)2 h，濾出沉淀，分別用水和甲醇清洗3次，烘干得半抗原H1（或H4）。

半抗原H2：1 mmol對羥基苯甲醛與1.1 mmol氯乙酸鈉于10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中在90～95 ℃下回流反應(yīng)5 h，冷卻，以0.5 mol/L HCl調(diào)pH值至沉淀完全，濾出沉淀; 沉淀采用乙酸乙酯重新溶解， 于分液漏斗中水洗，乙酸乙酯相經(jīng)干燥，除溶劑后，殘余物采用乙酸乙酯石油醚（8∶1， V/V）混合溶劑重結(jié)晶，烘干得中間體IM1 \\[12\\]，并進(jìn)一步采用H1的合成方法，與AOZ縮合合成得到半抗原H2。

半抗原H3：1 mmol對羥基苯甲醛溶于10 mL干燥DMF，于

Symbolm@@ 5 ℃攪拌下加入2 mmol NaH反應(yīng)10 min后，滴加1 mL溴丁酸乙酯，室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)混合物溶液中加20 mL甲醇和0.5 g NaOH，于60 ℃攪拌下反應(yīng)2 h后，蒸除溶劑，加入飽和NaHCO3溶液，乙酸乙酯萃取，萃余水相滴加0.5 mol/L HCl調(diào)pH值至沉淀完全，過濾，水洗，沉淀物烘干得中間體IM2。采用H1的合成方法，將IM2與AOZ縮合合成得到半抗原H3。

[TS（][HT5”SS]圖解1 半抗原合成路線圖

Scheme 1 Synthesis route of haptens[HT][TS）]

2.2.2 抗原制備及鑒定 采用活潑酯法將半抗原H1～H4分別與BSA或OVA偶聯(lián)，制備免疫原H2BSA～H4BSA和包被原H1OVA～H4OVA；另外，采用戊二醛法將AOZ直接與OVA交聯(lián)形成包被原H5OVA?？乖闹苽浼拌b定參考文獻(xiàn)\\[13，14\\]的方法進(jìn)行。

2.2.3 免疫程序 每種免疫原免疫3只6～8周齡Balb/c雌鼠（100

SymbolmA@ g/只），隔2周加強(qiáng)免疫一次，第4次免疫后斷尾取血，采用棋盤滴定法測定抗體效價及抑制\\[15\\]。

2.2.4 細(xì)胞融合與篩選

細(xì)胞融合及后期篩選、亞克隆參考冷泉港實(shí)驗(yàn)室手冊\\[16\\]的方法進(jìn)行。

2.2.5 單克隆抗體純化及特性鑒定

篩選的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并注射小鼠腹腔誘導(dǎo)腹水，辛酸硫酸銨法純化，采用Sigma公司鼠單克隆抗體分類試劑盒進(jìn)行亞型鑒定，間接ELISA測定，并計(jì)算抗體的親和力常數(shù)（KA）\\[17\\]。

2.2.6 ELISA工作條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 （1）間接競爭ELISA模式 ELISA反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)\\[18\\]進(jìn)行，通過包被濃度、抗體反應(yīng)時間、緩沖液體系、緩沖液體系中吐溫20含量的優(yōu)化，確定ELISA工作條件; （2）直接競爭ELISA模式 采用一步法將HRP直接標(biāo)記在單克隆抗體\\[19\\]，ELISA工作條件優(yōu)化同間接競爭模式; （3）標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用最佳ELISA工作條件，以AOZ的對硝基苯甲醛衍生物（pNPAOZ）濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以B/B0 （B為添加藥物時的吸光值，B0不添加藥物時的吸光值）為縱坐標(biāo)，按照B/B0logC 四參數(shù)對數(shù)擬合繪制不同包被原條件的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線\\[20\\]。

2.2.7 抗體特異性 采用間接競爭ELISA測定pNPAOZ及呋喃唑酮結(jié)構(gòu)功能類似物靈敏度IC50，根據(jù)下式計(jì)算交叉反應(yīng)率CR。

CR （%）＝100%×IC50 （pNPAOZ） /IC50 （類似物）（1）

3 結(jié)果與討論

3.1 半抗原/抗原設(shè)計(jì)合成與鑒定

合理的半抗原結(jié)構(gòu)是制備高親和力和高特異性抗體的關(guān)鍵，而合理的半抗原手臂的偶聯(lián)位點(diǎn)確保最大限度暴露待測對象分子特征結(jié)構(gòu)，避免偶聯(lián)蛋白后被載體蛋白三維結(jié)構(gòu)掩蓋，是動物機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，獲得高質(zhì)量抗體的重要因素\\[21，22\\]。本研究選擇能充分暴露AOZ特征結(jié)構(gòu)的遠(yuǎn)端苯環(huán)對位引入不同長度手臂，設(shè)計(jì)合成了免疫半抗原H2～H4；另外，異源包被可提高待測藥物的ELISA方法檢測靈敏度\\[12\\]，因而設(shè)計(jì)合成了H1OVA～H5OVA系列包被抗原。半抗原H1～H4的波譜鑒定數(shù)據(jù)如下：

H1: MS （ESI negative） m/z: 157 \\[M

Symbolm@@ H\\]

Symbolm@@ ; 1HNMR （600 MHz， d6DMSO， TMS）: δ 7.01 （s， 1H）; 4.51 （t， J＝7.8 Hz， 2H）; 3.86 （t， J＝8.4 Hz， 2H）。

H2: MS （ESI negative） m/z: 266 \\[M

Symbolm@@ H\\]

Symbolm@@ ; 1HNMR （600 MHz， d6DMSO， TMS）: δ 12.12 （s， 1H）; 7.84 （s， 1H）; 7.60 （d， J＝8.0 Hz， 2H）; 7.487.52 （m， 2H）; 7.18 （d， J＝8.0 Hz， 2H）; 4.51 （t， J＝8.0 Hz， 2H）; 3.95 （t， J＝8.0 Hz， 2H）; 2.66 （t， J＝8.0 Hz， 2H）; 2.36 （t， J＝8.0 Hz， 2H）; 1.88 （p， J＝7.4 Hz， 2H）。

H3: MS （ESI negative） m/z: 295 \\[M

Symbolm@@ H\\]

Symbolm@@ ; 1HNMR （600 MHz， d6DMSO， TMS）: δ 7.82 （s， 1H）; 7.67 （s， 1H）; 7.65 （d， J＝8.0 Hz， 2H）; 4.55 （s， 1H）; 4.47 （d， J＝8.0 Hz， 2H）; 4.13 （t， J＝8.4 Hz， 2H）; 3.93 （t， J＝8.0 Hz， 2H）; 2.34 （t， J＝8.0 Hz， 2H）; 1.88 （t， J＝9.0 Hz， 2H）。

H4: MS （ESI negative） m/z: 238 \\[M

Symbolm@@ H\\]

Symbolm@@ ; 1HNMR （600 MHz， d6DMSO， TMS）: δ 7.78 （s， 1H）; 7.65 （d， J＝8.0 Hz， 2H）; 6.99 （d， J＝8.0 Hz， 2H）; 4.48 （t， J＝8.0 Hz， 2H）; 3.92 （t， J＝8.0 Hz， 2H）。

采用紫外掃描法對免疫抗原H2BSA～H4BSA和包被抗原H1OVA～H5OVA進(jìn)行鑒定\\[13，16\\]。結(jié)果表明，與相應(yīng)半抗原和載體蛋白相比，偶聯(lián)物（免疫和包被抗原）最大吸收峰在210～230 nm及270～285 nm波長范圍變化明顯，具有半抗原結(jié)構(gòu)吸收特征，說明抗原合成成功。

3.2 免疫半抗原對抗體特性的影響?yīng)?/p>

小鼠免疫4次后測定抗血清，以H3BSA免疫的抗血清效價和ELISA靈敏度最高 （表1），說明連接載體蛋白的4個碳原子長度間隔手臂有利于半抗原的充分暴露；另外，手臂偶聯(lián)位點(diǎn)位于半抗原特征結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)端，有利于誘導(dǎo)動物產(chǎn)生高特異性免疫應(yīng)答。

[KH*4D][HT5”SS][*4]表1 免疫原及包被原對抗血清特性的影響?yīng)?/p>

Table 1 Influence of immunogen and coating antigen on against antiserum characteristics

[HT6SS][BG（][BHDFG5*2，WK7，WK50W]

包被抗原Coating antigens（1 mg/L）免疫抗原 ImmunogensH2BSA效價Titer抑制率Inhibition（%）[][]H3BSA效價Titer抑制率Inhibition（%）[]

H4BSA效價Titer抑制率Inhibition（%）

[BHDG1*2，WK7，WK8\\.2，WK1，WK8\\.2，WK1，WK8\\.2W]H1OVA1∶32000

821∶84000921∶1200080

H2OVA1∶128000651∶80000781∶2400064H3OVA1∶64000781∶200000701∶2400075

H4OVA1∶6400070

1∶150000751∶3200072

H5OVA1∶24000881∶32000951∶1000085[BHDFG４*2，WKZQ0W] 注（Notes）：效價值為A450≈1.0抗血清的稀釋倍數(shù) （The titer is the dilution of antiserum when the absorbance of 450 nm was about 1.0）；抑制率測定時pNPAOZ添加濃度為1 mg/L （The concentration of 3（（4nitrobenzylidene）amino）oxazolidin2one （pNPAOZ） is 1 mg/L for inhibition detection）; OVA: Ovalbumin[BG）W][HT][]

3.3 單克隆抗體純化及特性鑒定

H3BSA免疫原免疫的小鼠脾臟與其骨髓瘤細(xì)胞融合，間接競爭ELISA檢測細(xì)胞融合率為85%，陽性孔為40%。經(jīng)5次有限稀釋篩選到1株雜交瘤細(xì)胞，命名為4C3H9E3，多次傳代、凍存和復(fù)蘇其抗體分泌穩(wěn)定。采用辛酸硫酸銨法純化腹水獲得單克隆抗體，亞型鑒定為IgG1，純化后靈敏度（IC50）從2.95

SymbolmA@ g/L提升至2.51

SymbolmA@ g/L，表明純化除去腹水中的雜蛋白有利于抗體更好地識別抗原；另外，根據(jù)文獻(xiàn)\\[18\\]的方法，測定純化后的抗體濃度為6.79 g/L，采用間接ELISA測定并抗體親和力常數(shù)KA達(dá)6.68×1010 L/mol。

3.4 ELISA工作條件優(yōu)化

對包被濃度、抗體反應(yīng)時間、緩沖液體系、緩沖液中吐溫20含量等4個工作條件進(jìn)行優(yōu)化（圖1）。通過比較Amax/IC50的值大小，確定了ELISA最佳工作條件\\[23\\]：（1）icELISA：包被原濃度為125

SymbolmA@ g/L、抗體反應(yīng)時間為40 min、緩沖液體系為PBST0.05%吐溫20。（2）dcELISA：包被原濃度為250

SymbolmA@ g/L、抗體反應(yīng)時間為40 min、最優(yōu)稀釋溶液體系為PBST0.05%吐溫20。 

[TS（][HT5”SS]圖1 不同工作條件對間接競爭ELISA方法靈敏度的影響（以icELISA為例）

Fig．1 Influence of different working conditons on indirect ELISA sensitivity （icELISA）[HT][TS）]

3.5 包被原對ELISA靈敏度的影響?yīng)?/p>

基于上述最佳ELISA工作條件，考察了不同包被原對間接競爭和直接競爭ELISA藥物抑制效果

[FQ（1０\\.２５２，Y－ＷＺ][HT5”SS][*4]表2 不同包被原對ELISA檢測的IC50和線性工作范圍的影響?yīng)?/p>

Table 2 Influence of different coating hapten on IC50 and linear scope of work

[HT6SS][BG（][BHDFG5，WK8，WK12，WK1，WK12W]包被抗原Coating antigen間接競爭ELISA

Indirect competitive ELISA

（icELISA） （

SymbolmA@ g/L）IC50IC20～I(xiàn)C80

直接競爭ELISADirect comptitive ELISA （dcELISA） （

SymbolmA@ g/L）C50IC20～I(xiàn)C80

H1OVA2.03

0.24～49.594.45

0.42～78.48H2OVA37.28.37～237.439.4

10.49～304.6H3OVA56.832.21～479.773.8

45.42～531.2H4OVA16.851.34～207.3121.34

1.67～248.3H5OVA1.160.14～32.142.74

0.33～54.31[BG）Ｆ][HT][]

（表2）。結(jié)果顯示，靈敏度（IC50）從高到低依次為H5OVA＞H1OVA＞H4OVA＞ H2OVA ＞H3OVA，與包被原和免疫原結(jié)構(gòu)的異源性大小差異順序一致，其中H5OVA和H1OVA靈敏度結(jié)果相當(dāng)，且遠(yuǎn)大于H2OVA～ H4OVA，說明只含待測物質(zhì)對象AOZ特征結(jié)構(gòu)片段的異源包被，剔除了苯環(huán)，僅保留了AOZ特征結(jié)構(gòu)，可在充分保留抗原抗體分子識別特異性的前提下，降低包被抗原與抗體的親和力，從而提高抗體競爭識別待測分子的靈敏度\\[24\\]。另外，由于包被原H2OVA～ H4OVA上的半抗原結(jié)構(gòu)和待測物質(zhì)主體骨架結(jié)構(gòu)相同，導(dǎo)致其和抗體的親和力相當(dāng)，從而造成待測物質(zhì)的ELISA競爭檢測靈敏度不高\\[25\\]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇H5OVA作為最佳ELISA方法的包被原。

3.6 方法特異性

以呋喃唑酮結(jié)構(gòu)和功能類似的抗生素為待測物，分別采用icELISA和dcELISA模式，測定藥物抑制IC50，進(jìn)一步計(jì)算交叉反應(yīng)率（CR，%）表示抗體的特異性。結(jié)果表明， 抗AOZ 單克隆抗體與功能結(jié)構(gòu)類似的其它硝基呋喃類藥物均無交叉反應(yīng)，特異性良好（表3）。另外，唯一出現(xiàn)交叉反應(yīng)的是呋喃唑酮原藥，但作為檢測呋喃唑酮代謝物的方法，檢測其代謝物最終也是為了說明呋喃唑酮的使用與否。因此，與原藥的交叉并不影響對監(jiān)測結(jié)果的判定。

[KH*4D][HT5”SS][*4]表3 ELISA方法的單克隆抗體特異性測定

Table 3 Specificity of monoclonal antibodies for ELISA

[HT6SS][BG（][BHDFG５，WK12，WK8，WK*2，WK8，SK12，WK8，WK*2，WK8W]結(jié)構(gòu)式Structural formula間接競爭ELISA （icELISA）IC50

（

SymbolmA@ g/L）CR（%）直接競爭

ELISA （dcELISA）

IC50

（

SymbolmA@ g/L）CR

（%）結(jié)構(gòu)式Structural formula間接競爭ELISA （icELISA）IC50

（

SymbolmA@ g/L）CR（%）直接競爭

ELISA （dcELISA）

IC50

（

SymbolmA@ g/L）CR

（%）

1.161002.741003.63325.8846

2314＜0.12780＜0.1＞50 000＜0.01＞50 000＜0.01

＞50 000＜0.01＞50 000＜0.01[]＞50 000＜0.01＞50 000＜0.01

＞50 000＜0.01＞50 000＜0.01＞50 000＜0.01＞50 000＜0.01

＞50 000＜0.01＞50 000＜0.01[]＞50 000＜0.01＞50 000＜0.01

[BHDFG3，WKZQ0W] CR： 交叉反應(yīng)率（Cross reaction ratio）。[BG）W][HT][]

3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以125

SymbolmA@ g/L H5OVA為異源包被原，基[TS（][HT5”SS] 圖2 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig．2 ELISA standard curve[HT][TS）]于前述ELISA最佳工作條件，分別建立了檢測pNPAOZ的icELISA和dcELISA方法標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。在icELISA模式下，IC50為1.16

4 結(jié) 論

設(shè)計(jì)合成了新穎免疫半抗原H3，并成功制備獲得了具有高親和力、高特異性的抗AOZ單克隆抗體。在考察了不同結(jié)構(gòu)包被原對ELISA方法靈敏度的影響基礎(chǔ)上，采用最佳的僅含AOZ特征結(jié)構(gòu)片段的異源包被原H5OVA，建立了AOZ的icELISA和dcELISA檢測方法，檢測靈敏度和定量線性范圍均達(dá)到相關(guān)檢測限量要求，為開發(fā)滿足實(shí)際樣品不同檢測需求的直接和間接競爭ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)。

References

1 Vass M， Hruska K， Franek M. Veterinarni Medicina， 2008， [STBZ]53（9）： 469～500

2 LU DongLian， HAN HeYou， LIANG JianGong. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（5）: 715～７１８

陸冬蓮， 韓鶴友， 梁建功. 分析化學(xué)， 2010， 38（5）: 715～718

3 XU YiPing， XU ChuanLai. Food Science， 2007， [STBZ]28（10）： 590～593

徐一平， 胥傳來. 食品科學(xué)， 2007， [STBZ]28（10）： 590～593

4 Barbosa J， Moura S， Barbosa R， Ramos F. Anal. Chim. Acta， 2007， [STBZ]586（12）： 359～365

5 Rodziewicz L. J. Chromatogr. B， 2008， [STBZ]864（12）： 156160 

6 Zhu H P， Liu T T， Liu B， Yin H L， Li X L， Wang L， Wang S. Chin. Chem. Lett.， 2010， [STBZ]21（9）： 1049～1052

7 CHANG Chao， WU JinE， YUAN ZongHui. Chinese J. Anal. Chem.，  2009， 37(4): 527～５３１

常 超， 伍金娥， 袁宗輝. 分析化學(xué)， 2009， 37(4): 527～５３１

8 Chang C， Peng D P， Wu J E， Wang Y L， Yuan Z H. J. Agric. Food Chem.， 2008， [STBZ]56（12）： 1525～1531

9 Cooper K M， Caddell A， Elliott C T， Kennedy D G. Anal. Chim. Acta， 2004， [STBZ]520（12）： 79～86

10 Liu Y， Huang L L， Wang Y L， Yang B， Ishan A， Fang K， Peng D P， Liu Z L， Dai M H， Yuan Z H . J. Agric. Food Chem.， 2010， [STBZ]58（11）： 6774～6779

11 Diblikova I， Cooper K M， Kennedy D G， Franek M. Anal. Chim. Acta， 2005， [STBZ]540（2）： 285～292

12 WANG Yu， SHEN YuDong， XU ZhenLin， LEI HongTao， WANG Hong， SUN YuanMing. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， [STBZ]38（3）： 313～317

王 宇， 沈玉棟， 徐振林， 雷紅濤， 王 弘， 孫遠(yuǎn)明. 分析化學(xué)， 2010， [STBZ]38（3）： 313～317

13 Kim Y J， Cho Y A， Lee H S， Lee Y T， Gee S J， Hammock B D. Anal. Chim. Acta， 2003， [STBZ]475（12）： 85～96

14 Singh K V， Kaur J， Varshney G C， Raje M， Suri C R. Bioconjugate Chem.， 2004， [STBZ]15（1）： 168～173

15 Liu Y， Peng D P， Huang L L， Wang Y L， Chang C， Ihsan A， Tao Y F， Yang B， Yuan Z H. Anal. Chim. Acta， 2010， [STBZ]664（2）： 151～157 

16 Harlow E， Lane D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， New York， 1988: [STBZ]139～242

17 James W G. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press， Inc Ltd， 1983: 142～147

18 PENG FangYi， JIANG HaiRong， CHEN YuanXiang， CHEN ShengZhen， LIN ZhiHua， LIAO Po， HE Miao， SHI HanChang， CAI Qiang. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（12）： 1737～1741

彭方毅， 姜海蓉， 陳遠(yuǎn)翔， 陳勝珍， 林治華， 廖 璞， 何 苗， 施漢昌， 蔡 強(qiáng). 分析化學(xué)， 2010， 38（12）： 1737～1741

19 ZHU LiPing， CHEN XueQing. I(xiàn)mmunology experimental methods. People′s military medical press， 2000： 351～357

朱立平， 陳學(xué)清. 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法. 人民軍醫(yī)出版社， 2000： 351～357

20 Gosling J P. I(xiàn)mmunoassays A Practical Approach. America: Oxford University Press. 2000： 41

21 Krongpong L， Futami K， Katagiri T， Endo M， Maita M. Fisheries Science， 2008， 74（5）： 1055～1061 

22 XIE GuiMian， SUN YuanMing， XU ZhenLin， LI YongXiang， LEI HongTao， WANG Hong， SHEN YuDong. Chem. J. Chinese Universities， 2009， 30（11）： 2193～2198

謝桂勉， 孫遠(yuǎn)明， 徐振林， 李永祥， 雷紅濤， 王 弘， 沈玉棟. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 30 （11）： 2193～2198

23 WANG BaoLing， YUAN LiPeng， LEI HongTao， XU ZhenLin， YANG JinYi， SUN YuanMing， DING Wu， PANG Jie. Food Science， 2010， 31（20）： 270～274

王保玲， 袁利鵬， 雷紅濤， 徐振林， 楊金易， 孫遠(yuǎn)明， 丁 武， 龐 杰. 食品科學(xué)， 2010， 31（20）： 270～274

24 Li J， Liu J， Zhang H C， Li H， Wang J P. Anal. Chim. Acta， 2010， 678（1）： 1～6

25 Xu Z L， Xie G M， Li Y X， Wang B F， Beier R C， Lei H T， Wang H， Shen Y D， Sun Y M. Anal. Chim. Acta， 2009， 647（1）： 90 ～96

Production and Identification of Monoclonal Antibody

Against Furazolidone Metabolites and Development

of EnzymeLinked Immunosorbent Assay



REN HaiTao， SHEN YuDong， XU ZhenLin， YANG JinYi， LEI HongTao，

XIAO ZhiLi， WANG Hong， SUN YuanMing*



 （Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province/College of Food Science， 

South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）





Abstract Several new haptens for furazolidone metabolites 3amino2oxazolidnone （AOZ） were synthesized and coupled to bovine serum albumin （BSA） as immunogen and used to immunize Balb/c mice. A cell strain secreting antiAOZ monoclonal antibody from hapten H3 was obtained by cell fusion and screening. The titer of antibod was 1∶2000000， the subtype was IgG1 and the affinity constant was equal to 6.68×1010 L/mol. The monoclonal antibody obtained was highly specific to AOZ. Furthermore， based on investigating the effect of homology and heterologous coating antigens with different structures on the ELISA sensitivity， indirect competitive ELISA （icELISA） and direct competitive ELISA （dcELISA） test methods could be established with H5OVA as the best heterologous coating antigen. The IC50， limit of detection and linear range for AOZ were 1.189

（Received 29 April 2011; accepted 30 November 2011）

分析化學(xué)簡明手冊（ISBN 9787122074768）

該書對常用分析方法的基本原理、儀器設(shè)備、工作條件和應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)行了全面系統(tǒng)的介紹，包括化學(xué)基礎(chǔ)知識、定性分析、重量分析、滴定分析、電化學(xué)分析方法、分子光譜分析、原子光譜分析、X射線光譜分析、色譜法、其他譜學(xué)分析方法和化學(xué)分離富集方法，同時收錄了各種重要的分析化學(xué)數(shù)據(jù)資料。本書力求將理論與實(shí)踐相結(jié)合，反映當(dāng)代分析化學(xué)的最新面貌，為廣大分析化學(xué)工作者提供一本使用方便，又簡單明了的常備工具書。該書可供廣大分析檢測工作者及分析化學(xué)研究人員閱讀和參考，還可供高等院校、大、中專學(xué)校相關(guān)專業(yè)師生教學(xué)參考。

該書由化學(xué)工業(yè)出版社出版，周春山、符斌 主編，定價 98.0元。