代謝組學(xué)方法研究姜黃根莖及塊根次生代謝產(chǎn)物表達(dá)差異

摘 要 [HTSS]基于GCMS的代謝組學(xué)分析方法，建立了分析不同產(chǎn)地來源的姜科植物姜黃（Curcuma. Longa L）的根莖（中藥姜黃）和塊根（中藥郁金）的次生代謝產(chǎn)物的方法。對樣品的提取方法、氣相升溫條件和方法學(xué)進(jìn)行了考察，確定采用石油醚索氏提取法對樣品進(jìn)行提取。色譜圖中主要化合物的精密度為1.2%～5.7%；重現(xiàn)性為2.18%～6.27%； 回歸系數(shù)R2＝0.699～0.972。數(shù)據(jù)處理采用SIMCAP軟件進(jìn)行主成分（PCA）分析，通過主成分得分圖（Score plot）可以明顯區(qū)分姜黃的根莖及塊根樣品，說明在根莖和塊根中次生代謝產(chǎn)物的表達(dá)存在差異；通過載荷圖（Loading）和t檢驗（ttest）發(fā)現(xiàn)了14種表達(dá)差異顯著的化合物。這些化合物可能是姜黃根莖與塊根具有不同藥性和臨床用途的物質(zhì)基礎(chǔ)。

[KH*3/4D][HTH]關(guān)鍵詞 [HTSS]次生代謝物； 姜黃； 氣相色譜質(zhì)譜； 主成分分析

[HT][HK]

[FQ（3２，X，DY－Ｗ][CD15] 20110907收稿；20111116接受

本文系科技部國際合作項目（No.2009DFA31660）和973項目（No.2006CB504701）資助

* Email:huangluqi@263.net[HT]

1 引 言

代謝組學(xué)是對某種生物或細(xì)胞的所有低分子量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析的一門學(xué)科。代謝組學(xué)主要采用現(xiàn)代分析技術(shù)（例如，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振等）對植物次生代謝產(chǎn)物及機(jī)體內(nèi)源性小分子代謝物進(jìn)行分析，并采用模式識別技術(shù)對分析結(jié)果進(jìn)行區(qū)分與判別，從中發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)識物，應(yīng)用于疾病診斷、毒理機(jī)制研究和功能基因組學(xué)研究等方面\\[1，2\\]。

本研究借鑒代謝代組學(xué)的研究思路，對姜科植物姜黃（Curcuma. Longa L）的根莖和塊根的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。2010版中國藥典記載，姜黃的根莖和塊根作為兩種不同的中藥（姜黃和郁金），具有相反的藥性和不同的臨床用途\\[3～5\\]。由于二者來源于同一植物，其化學(xué)成分類型基本一致\\[6～9\\]。一直以來很難從植物化學(xué)的角度說明二者藥效差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究采用GCMS的代謝組學(xué)分析方法，對不同產(chǎn)地的姜黃的根莖和塊根進(jìn)行分析。本研究采用主成分分析（PCA）方法對分析結(jié)果進(jìn)行建模處理。結(jié)果表明，主成分得分圖（Score plot）可以成功區(qū)分根莖（中藥姜黃）和塊根（中藥郁金）兩組樣品，說明二者次生代謝產(chǎn)物的表達(dá)存在差異；通過分析主成分分析載荷圖（Loading plot），確定了14種表達(dá)存在顯著差異的代謝產(chǎn)物，這些化合物可能是姜黃根莖與塊根具有不同藥性和臨床用途的物質(zhì)基礎(chǔ)。2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

GCMSQP2010 Plus氣相色譜質(zhì)譜儀（日本島津公司），配有自動進(jìn)樣器， GCMS solution 2.5工作站和NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，離子源（Ion source） 為EI（電子轟擊）源。色譜柱采用ZB5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25

SymbolmA@ m，德國MachereyNagel公司）， 臺式高速離心機(jī)（美國Labnet公司）、Sartorious BT 25S 型1/100000電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）、索氏提取器。軟件：GCMSsolution version 2.5（SHIMADZU Corporation）， SIMCAP＋12.0（Umetrics，Sweden）， Microsoft Excel2003（Microsoft Corporation），色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（國家藥典委員會）。

石油醚（沸程60～90 ℃，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

樣品收集：姜科植物姜黃樣品采自四川省，采樣點(diǎn)分別為崇州市三江鎮(zhèn)宋橋村、崇州市聽江鎮(zhèn)三橋村、雙流縣金橋鎮(zhèn)舟渡村。每個采樣點(diǎn)采集樣品6份，樣品經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所黃璐琦研究員鑒定為姜科植物姜黃。

2.2 樣品制備方法

取收集的樣品按中國藥典2010版進(jìn)行處理：分別取藥用部位（根莖和塊根）洗凈、切厚片、曬干、編號，其根莖即中藥材姜黃，塊根即中藥材郁金。

取姜黃（郁金）飲片粉碎、過20目篩（0.9 mm粒徑）；準(zhǔn)確稱取10 g粉末，置于索氏提取器中，加入50 mL石油醚；連續(xù)提取8 h， 至新提取的液滴基本無色；將提取液移入50 mL容量瓶，用石油醚定容。

2.3 色譜和質(zhì)譜條件

固定相采用低極性毛細(xì)管柱，根據(jù)GC/MS圖譜中的峰的分離情況和主要色譜峰的響應(yīng)值，確定色譜參數(shù)。

采用OPTIMA5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25

SymbolmA@ m）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；氣流模式：恒流流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量1

SymbolmA@ L，分流（Splite）比1∶10；離子源為EI， 離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍m/z 400～800，掃描速度5000 aum/s。溶劑延遲4.5 min。 柱溫采用程序升溫：80 ℃（5 min） 8 ℃/min280 ℃（2 min）。

 分 析 化 學(xué)第40卷

第5期吳宏偉等： 代謝組學(xué)方法研究姜黃根莖及塊根次生代謝產(chǎn)物表達(dá)差異 

2.4 色譜圖處理和統(tǒng)計分析

色譜圖中各化合物通過工作站GCMSsolution version 2.5自帶的NIST 2002質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定，原始圖譜經(jīng)積分后（信噪比S/N＞3），結(jié)果保存為文本格式。將文本文件（調(diào)整格式后）導(dǎo)入色譜指紋圖譜相似度評價軟件，將峰的匹配結(jié)果保存為Excel文件。上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP＋12.0進(jìn)行分析。采用主成分分析（PCA），通過得分圖（Scores plot）直觀地表達(dá)組間的代謝差異；通過載荷圖（Loading plot）初步篩選差異變量；通過ttest 對上述差異變量進(jìn)行統(tǒng)計檢驗，確定差異代謝產(chǎn)物。3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理方法的選擇

以甲醇提取劑時，由于其極性較大，易造成大極性成分在柱內(nèi)殘留，且姜黃次生代謝產(chǎn)物主要為萜類化合物，故本研究選擇石油醚為提取劑。采用索氏提取法，以保證樣品制備的重復(fù)性。提取時間分別考察考察了1， 2， 5， 8和12 h，根據(jù)色譜圖譜中峰的數(shù)量及響應(yīng)值確定提取時間為8 h。

3.2 GCMS條件優(yōu)選及樣品分析

為了獲得良好的色譜分離度，本研究對氣相色譜的升溫程序進(jìn)行了優(yōu)化，考察了3種不同的升溫程序，最終確定了最佳的色譜條件見2.3節(jié)。由于儀器在開機(jī)時需要自動調(diào)諧，以保證質(zhì)譜參數(shù)與出廠時一致。因此，本研究未對質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，而是維持其固有設(shè)置不變。本實驗分離鑒定姜黃的根莖和塊根中共43種萜類次生代謝物，主要次生代謝產(chǎn)物如圖1所示。

[TS（][HT5”SS]圖1 姜黃（A）、郁金（B）GCMS總離子流色譜圖和匹配色譜圖（C）

Fig．1 GCMS TIC chromatograms of Turmeric （A）， and Radix curcumae （Tuberous root） （B）， and all samples（C）

1.α蒎烯（αPinene）； 2.莪術(shù)烯醇（Curcumenol）； 3.β月桂烯（βMyrcene）； 4.β蒎烯（βpinene）； 5.莰烯（Camphene）； 6.龍腦（Borneol）； 7.桉葉油素（1，8Eucalyptol）； 8.姜黃烯（Curcumene）； 9.芳姜黃烯（ArCurcumene）； 10. β姜烯（βZingiberene）； 11.β倍半水芹烯（βSesquiphellandrene）； 12.芳姜黃酮（ArTurmerone）； 13.姜黃酮（Tumerone）。[HT][TS）]

3.3 方法學(xué)考察隨機(jī)選取9種共有峰的峰面積為指標(biāo)，進(jìn)行方法學(xué)考察（表1）。

取同一個樣品， 制備完后連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)色譜峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察精密度。結(jié)果表明，各色譜峰峰面積RSD在1.2%～5.7%范圍內(nèi)。

取同一個樣品，粉碎過篩后平行制備6份并進(jìn)行測定，根據(jù)各峰面積計算RSD，考察重復(fù)性。 結(jié)果表明，各色譜峰峰面積RSD在2.2%～6.3%范圍內(nèi)。

取同一樣本15 g，加入20 mL石油醚，索氏提取8 h后，以石油醚定容至25 mL。制備完后，按2， 5， 10和20倍稀釋成5份樣品，根據(jù)主要色譜峰面積和相對濃度，考察線性關(guān)系，并計算回歸系數(shù)（R2）在0.699～0.972之間。由于樣品成分復(fù)雜，對離子化影響較大，所以個別化合物的回歸系數(shù)較低。但是， 在統(tǒng)計分析中，各化合物匹配對齊后是以其相對含量進(jìn)行統(tǒng)計，因此在重復(fù)性、精密度復(fù)合要求的前提下，個別化合物的回歸系數(shù)較低對統(tǒng)計結(jié)果無影響。檢測結(jié)果表明，所測樣品中相應(yīng)峰面積均在線性范圍內(nèi)。

[LM][HT5”SS][*4]表1 方法學(xué)考察結(jié)果

Table 1 Results of methodological study

[HT6SS][BG（][BHDFG４，WK7，WK20，WK10\\.3W]峰號Peak No.化合物

Compound精密度Precision（RSD， %， n＝6）重復(fù)性

Reproducibility（RSD， %， n＝6）回歸系數(shù)Regression coefficientR2

1α蒎烯 αPinene2.15.70.7012莪術(shù)烯醇 Curcumenol3.45.80.9323β月桂烯βMyrcene5.65.７0.8227

桉葉油素1，8Eucalyptol3.26.20.8949芳姜黃烯ArCurcumene4.65.50.78810β姜烯βZingiberene3.14.00.972

11β倍半水芹烯 βSesquiphellandrene1.26.30.85312芳姜黃酮Arturmerone

4.33.40.69913姜黃酮 Tumerone1.32.20.901[BHDFG3，WKZQ0W] * 峰號同圖1（Peak numbers are the same as in Fig.1）。[BG）W][HT][]

3.4 統(tǒng)計分析結(jié)果

本研究采用主成分分析法對化學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行處理。主成分分析為無監(jiān)督模式識別技術(shù)，不考慮樣品的分類信息，通過對高維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維后，對樣品進(jìn)行判斷。

結(jié)果表明，主成分得分圖可以從整體上直觀的顯示樣品間的差異。如圖2A所示，除個別樣品外，姜黃和郁金的樣本分別聚為一類，完全分離；說明姜黃的根莖和塊根次生代謝產(chǎn)物的表達(dá)存在差異。

主成分分析載荷圖為進(jìn)一步確定化合物的含量差異提供了幫助。如圖2B所示，載荷圖上每個點(diǎn)代表一個變量，離原點(diǎn)距離越遠(yuǎn)，表明該成分含量變化對分類的貢獻(xiàn)越大。經(jīng)t檢驗，從中確定了14種代謝產(chǎn)物，其含量表達(dá)在姜黃和郁金間差異顯著。質(zhì)譜圖與NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表2。

[TS（][HT5”SS]圖2 主成分分析得分圖（scores plot）（A）和主成分分析的載荷圖（B）

Fig．2 Score plot （A） and Loading Plot（B） of PCA

□郁金（Radix curcumae）； ○ 姜黃（Turmeric）。[HT][TS）]

[HT5”SS][*4]表2 姜黃、郁金中14種差異次生代謝產(chǎn)物及相對含量比較

Table 2 Fourteen secondary metabolites of significantly different content between Turmeric and Radix curcumae of Curcuma longa L.

[HT6SS][BG（][BHDFG4，WK7，WK10，WK20，WK20W]編號

No.保留時間RT （min）化合物的鑒定Identified compound相對含量a Relative content郁金

Radix curcumae姜黃

Turmeric

12.868α蒎烯 αPinene10.34±3.5623.29±10.11*23.817莪術(shù)烯醇 Curcumenol

8.78±4.1111.72±3.45*34.844β月桂烯 βMyrcene10.21±3.234.91±1.11*46.090

異龍腦 Isoborneol1.11±0.343.78±0.21*56.267

龍腦 Borneol5.12±1.561.23±0.12*67.010

反10生姜醇 10Gingerol8.11±2.672.12±0.45*7

8.576桉葉油素 1，8Eucalyptol0.62±0.088.73±1.78*

912.970芳姜黃烯 ArCurcumene3.22±1.455.52±0.45*913.134αHimachalene1.43±0.345.12±2.22*1013.517β姜烯 βZingiberene7.88±2.1610.82±4.67*1114.487倍半水芹烯 βSesquiphellandrene4.33±1.7811.18±2.45*1215.483

芳姜黃酮 Arturmerone18.45±8.9829.48±10.34*13

15.574姜黃酮 Tumerone20.45±7.8838.23±11.23*1415.765姜黃新酮 Curlone10.33±5.6717.86±6.78*

*: 經(jīng)t檢驗（ttest）； P＜0.05; a: 峰面積與樣品質(zhì)量比（The ratio of peak area to sample mass， mAUs×105 intensity/g mean±SD， n＝18）。

在14種代謝物中，除月桂烯（βMyrcene）、龍腦（Borneol）和生姜醇（10Gingerol）外，其余化合物在根莖中的含量均明顯高于塊根。姜黃植物中萜類化合物多具有抗炎、降脂、抗癌等方面的活性\\[10，11\\]。由于在根莖和塊根中的含量差異，導(dǎo)致其在體內(nèi)的吸收、代謝及藥效的不同，最終導(dǎo)致其作為兩種中藥應(yīng)用于臨床，并且對其藥性的認(rèn)識也不同。

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

Metabonomic Study on Secondary Metabolites of Rhizome and

Tuberous Root of Curcuma longa L

WU HongWei， LI HongMei， TANG LiYing， XU HaiYu，

LI ShaoJing， TANG ShiHuan， YANG HongJun， SHAO AiJuan， HUANG LuQi*

（Institute of Chinese Materia Medica， Chinese Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）



Abstract A metabonomic method of GCMS was developed to investigate the difference of secondary metabolites in the rhizome and tuberous root of Curcuma longa L. The extraction conditions， temperature program and methodology were optimized. Using the petroleum ether as the extraction solvent and Soxhlet extraction， the method displayed good precision（RSD: 1.2%－5.7%）， repeatability（RSD: 2.2%－6.3%） and linearity （R2: 0.699－0972）. The analysis data were performed by SIMCAP software. Scores plot of PCA could successfully divide the rhizome and tuberous root samples into two groups respectively， which illustrate the difference of secondary metabolites between the rhizome and tuberous root. With the loading plot and ttest， the significant difference in two groups of fourteen endogenous metabolites were found， which may be the effective substance for explaining the different usage of the rhizome and tuberous root of Curcuma longa L. in Chinese medicine.

Keywords Secondary metabolites; Curcuma. Longa L; Gas chromatographymass spectrometry；Principal component analysis

（Received 7 September 2011; accepted 16 November 2011）