石墨烯-聚多巴胺納米復(fù)合材料制備過(guò)氧化氫生物傳感器

摘 要 通過(guò)合成具有仿生功能的石墨烯聚多巴胺納米材料，將其與辣根過(guò)氧化酶組裝到電極表面，以對(duì)苯二酚為電子媒介體制備H2O2傳感器。此修飾電極對(duì)H2O2具有良好的電催化活性，檢測(cè)的線性范圍為5.0×10－7～3.3×10－4 mol/L；線性回歸方程為Y＝29.69x＋0.04577，相關(guān)系數(shù)為R＝0.9995; 檢出限為3.7×10－7 mol/L （S/N＝3）。

關(guān)鍵詞 聚多巴胺； 石墨烯； 對(duì)苯二酚； 辣根過(guò)氧化物酶； 過(guò)氧化氫

1 引 言

納米材料由于具有良好的導(dǎo)電性及生物相容性， 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的制備中^[1～4]。2004年，Geim等首次發(fā)現(xiàn)二維晶體石墨烯（GR）的存在。由于其獨(dú)特的電學(xué)、光學(xué)及催化性能，被廣泛應(yīng)用于生物傳感器及電催化領(lǐng)域^[5，6]。結(jié)構(gòu)完整的石墨烯是由不含任何不穩(wěn)定鍵的苯六元環(huán)組合而成的二維晶體，表面呈惰性使其具較高的化學(xué)穩(wěn)定性。與其它溶劑的相互作用較弱，同時(shí)石墨烯的片與片之間有較強(qiáng)的范德華力，容易聚集，這給石墨烯的研究和應(yīng)用造成了極大的困難。因此，對(duì)其進(jìn)行有效的功能化修飾非常重要^[7～9]。

聚多巴胺是貝殼、蚌等生物分泌的粘性蛋白的主要成分，具有極強(qiáng)的粘附性，能穩(wěn)定地固定在各種基質(zhì)上^[10，11]。Lee等^[12]以多巴胺（DA）為單體，通過(guò)簡(jiǎn)單的自聚合反應(yīng)在各種基質(zhì)表面形成了仿生聚多巴胺膜（PDA），該聚多巴胺膜不僅具有良好的粘附性，同時(shí)保持了原有單體良好的生物相容性。聚多巴胺薄膜被廣泛地應(yīng)用于對(duì)Au和Pt納米顆粒、碳納米管、石墨烯氧化物的表面修飾^[13～15]。

多巴胺特有的還原性可以作為氧化石墨烯（GO）的還原劑。聚多巴胺良好的粘附性和生物相容性又可以作為石墨烯的保護(hù)劑。本研究利用聚多巴胺膜對(duì)基底極強(qiáng)的結(jié)合力及其良好的生物活性，通過(guò)一步反應(yīng)法合成具有仿生功能的石墨烯聚多巴胺（GRPDA）納米復(fù)合材料，并將其引入過(guò)氧化氫傳感器的制備中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)過(guò)氧化氫的快速、靈敏檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Chi660a電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；Lambda 35紫外光譜儀（PerkinElmer公司）；782雙向磁力加熱攪拌器（金壇市新航儀器廠）；SK1200H超聲波清洗器（上?？茖W(xué)超聲儀器有限公司）；AJⅢa原子力顯微鏡（上海愛(ài)建納米科技發(fā)展有限公司）。

鹽酸多巴胺（CP阿拉丁試劑）；辣根過(guò)氧化物酶（≥250 U/mg上海三杰生物技術(shù)有限公司）；對(duì)苯二酚（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；H2O2（分析純，汕頭西隴化工有限公司）；石墨粉（汕頭西隴化工有限公司）。

2.2 GRPDA仿生材料的制備

通過(guò)改進(jìn)的Hummers方法^[16～18]制備GO。

GRPDA仿生材料的制備^[13]：10 mg GO加入到20 mL， 磷酸鹽緩沖液 （pH＝8.0） 中，攪拌下通N2 10 min，加入5 mg鹽酸多巴胺，冰水浴下超聲10 min，60 ℃下強(qiáng)烈攪拌24 h，反應(yīng)過(guò)程用紫外可見光譜監(jiān)測(cè)。冷卻后離心，反應(yīng)混合物用蒸餾水洗滌3次，重新分散到20 mL蒸餾水中，得到0.5 g/L黑色懸浮液。

2.3 HRP酶的固定

取上述0.5 g/L GRPDA懸浮液120L 2 g/L HRP混合， 超聲10 min，在冰箱4 ℃里放置12 h，使其達(dá)到平衡狀態(tài)。

2.4 修飾電極的制備

電極預(yù)處理：玻碳電極分別用0.3和0.05

3 結(jié)果與討論

3.1 紫外可見光譜

采用紫外可見吸收光譜對(duì)多巴胺還原氧化石墨烯過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果如圖1所示：氧化石墨烯的吸收峰位于230和300 nm處。隨著還原反應(yīng)的進(jìn)行，氧化石墨烯的吸收峰消失，在263 nm處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰，可歸為石墨烯的吸收峰^[6，13]。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值逐漸增大，且溶液逐漸由渾濁變得澄清，說(shuō)明多巴胺與氧化石墨烯發(fā)生反應(yīng)；在將氧化石墨烯還原成石墨烯的同時(shí)，氧化石墨烯作為氧化劑又將多巴胺氧化聚合生成聚多巴胺，得到了GRPDA納米復(fù)合材料。在石墨烯表面沉積的聚多巴胺由于其表面大量的親水基團(tuán)又極大地提高了石墨烯的水溶性。

3.2 原子力顯微鏡表征

對(duì)合成的GRPDA納米復(fù)合材料進(jìn)行了AFM表征。如圖2所示，GO片層厚度為0.60 nm；GO被多巴胺還原生成GR，

3.3 交流阻抗圖

圖3是幾種修飾電極在0.5 mol/L KCl＋2 mmol/L K4Fe（CN）6/K3Fe（CN）6 溶液中的交流阻抗圖，根據(jù)Nyquist圖中的半圓直徑可以求出電極的電子傳遞電阻^[19]。由圖3可知，裸玻碳電極阻抗為40 Ω；當(dāng)在玻碳電極表面修飾一層HRP/Nafion膜后，電極的阻抗增大到2700 Ω；當(dāng)用GO/HRP/Nafion膜修飾電極時(shí)，電極的阻抗減小到1200 Ω；當(dāng)用GRPDA/HRP/Nafion膜修飾電極時(shí)，電極的阻抗減小到300 Ω。說(shuō)明聚多巴胺仿生功能化的石墨烯具有良好的導(dǎo)電性，能提高電子的傳遞速率，可應(yīng)用于傳感器的構(gòu)建中。

圖3 不同修飾電極在0.5 mol/L KCl＋2 mmol/L K4Fe（CN）6/K3Fe（CN）6 溶液中的交流阻抗圖

Fig．3 Nyquist plots of bare GCE （a）， GCE/GRPDA/HRP/Nafion （b）， GCE/GO/HRP/Nafion （c）， GCE/HRP/Nafion （d） electrodes in 0.5 mol/L KCl＋2 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6 aqueous solution

進(jìn)一步考察GCE/GRPDA/HRP/Nafion電極在不同掃速下的電化學(xué)行為，研究了其峰電流與掃速關(guān)系，發(fā)現(xiàn)電流與掃速的平方根呈線性關(guān)系，表明修飾電極反應(yīng)受表面擴(kuò)散控制。

3.4 循環(huán)伏安法表征

圖4A比較了H2O2在GCE/GRPDA/HRP/Nafion和GCE/HRP/Nafion電極上的循環(huán)伏安曲線，發(fā)現(xiàn)使用石墨烯修飾的電極對(duì)H2O2的電催化還原峰電流明顯大于未使用石墨烯修飾的電極，且還原峰電位正移了85 mV，表明該石墨烯修飾電極對(duì)H2O2有很強(qiáng)的電催化活性，并且可以有效減圖4 （A） GCE/HRP/Nafion電極（線1和線2）與GCE/GRPDA/HRP/Nafion電極（線3和線4）在不含H2O2 （線1和線3）和含有1.0 mmol/L H2O2的PBS溶液 （線2和線4）中的CV曲線; （B） GCE/GRPDA/HRP/Nafion電極在含有0（a）， 0.2（b）， 0.4（c）， 0.6（d）， 0.8（e）， 1.0 （f） mmol/L H2O2的PBS溶液中的CV曲線

3.5 電極過(guò)程的機(jī)理

以HQ為媒介體的過(guò)氧化氫生物傳感器的催化過(guò)程原理如下：

H2O2＋HRP→HRPⅠ＋H2O（1）

HRPⅠ＋HQ （Red） →HRPⅡ＋HQ （Ox）*→HRP＋HQ （Ox） （2）

HQ （Ox）＋2H＋＋2e →HQ （Red） （3）

HQ （Ox）被還原為HQ （Red），從而形成還原電流。

石墨烯表面存在大量類似于斷層的結(jié)構(gòu)缺陷，能提供較多的反應(yīng)活性位點(diǎn)，同時(shí)由于其優(yōu)良的導(dǎo)電性能，又能促進(jìn)酶活性中心與電極間的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程。因此聚多巴胺石墨烯復(fù)合材料既具有石墨烯的優(yōu)良的電催化性能， 又表現(xiàn)出良好的生物相容性。其對(duì)過(guò)氧化氫表現(xiàn)出良好的電催化活性，使過(guò)氧化氫能夠在較正的電位下發(fā)生電催化還原反應(yīng)。 圖5 GCE/HRP/Nafion （a）， GCE/GO/HRP/Nafion （b）， GCE/GRPDA/HRP/Nafion （c）對(duì)H2O2的it響應(yīng)曲線，工作電位: 0 V

Fig．5 Chronoamperometric responses for GCE/HRP/Nafion （a）， GCE/GO/HRP/Nafion （b）， GCE/GRPDA/HRP/Nafion （c） upon subsequent additions of H2O2 in PBS solution. Potential applied: 0 V

3.6 不同修飾電極的電化學(xué)性質(zhì)比較

圖5比較了3種不同修飾電極對(duì)H2O2的it響應(yīng)曲線，發(fā)現(xiàn)聚多巴胺仿生功能化的石墨烯修飾電極對(duì)H2O2的響應(yīng)電流明顯增大。石墨烯由于其巨大的比表面積及優(yōu)良的導(dǎo)電性能能夠?yàn)镠RP活性中心與電極表面的電子傳遞提供快速通道，同時(shí)由于聚多巴胺膜的生物相容性能有效保護(hù)HRP的生物活性。因此， GRPDA復(fù)合材料能極大地促進(jìn)酶活性中心與電極間的電子傳遞速率，對(duì)H2O2有很強(qiáng)的電催化活性，提高檢測(cè)的靈敏度。

3.7 it曲線法檢測(cè)H2O2的濃度

在0 V恒定電位下，連續(xù)加入不同濃度的H2O2，考察GCE/GRPDA/HRP/Nafion修飾電極對(duì)H2O2的電流響應(yīng)。如圖6所示，傳感器對(duì)H2O2有快速靈敏的響應(yīng)，響應(yīng)電流在5 s內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流的95%。 圖6 GCE/GRPDA/HRP/Nafion修飾電極對(duì)H2O

mol/L時(shí)，加入4倍濃度的抗壞血酸，L半胱氨酸、甘氨酸、L組氨酸對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均不產(chǎn)生明顯干擾，說(shuō)明此傳感器對(duì)H2O2具有良好的選擇性。

3.9 傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

采用此電極平行測(cè)定1.0 mmol/L H2O2 10次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%。將修飾電極置于4 ℃的冰箱中考察其穩(wěn)定性，每隔7 d測(cè)定一次，28 d后仍保留響應(yīng)電流的70%左右，表明此電極具有較好的穩(wěn)定性。

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References

1 WANG MeiFang， ZHANG Wei， FANG Bin. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（1）: 125～128

汪美芳，張 偉，方 賓. 分析化學(xué)， 2010， 38（1）: 125～128

2 Willner I， Willner B， Katz E. Bioelectrochemistry， 2007， 70（1）: 2～11

3 Pandey P， Datta M， Malhotra B D. Anal. Lett.， 2008， 41（2）: 159～209

4 Valentini F， Palleschi G. Anal. Lett.，  2008， 41（4）: 479～520

5 Novoselov K S， Geim A K， Morozov S V， Jiang D， Zhang Y， Dubonos S V， Grigorieva I V， Firsov A A. Science， 2004， 306（5696）: 666～669

6 Shan C S， Yang H F， Han D X， Zhang Q X， Ivaska A， Niu L. Biosens. Bioelectron.， 2010， 25（5）: 1070～1074

7 HUYaoJuan， JIN Juan， ZHANG Hui， WU Ping， CAI ChenXin. Acta Phys. Chim. Sin. ， 2010， 26（8）: 2073～2086

胡耀娟，金 娟，張 卉，吳 萍，蔡稱心. 物理化學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 26（8）: 2073～2086



8 Wang G. X， Shen X P， Wang B， Yao J， Park J. Carbon.， 2009， 47（5）: 1359～1364

9 Zhu C Z， Guo S J， Fang Y X， Dong S J. ACS Nano， 2010， 4（4）: 2429～2437 

10 Lee H， Rho J， Messersmith P B. Adv. Mater.， 2009， 21（4）: 431～434

11 Dalsin J L， Hu B H， Lee B P， Messersmith P B. J. Am. Chem. Soc.， 2003， 125（14）: 4253～4258

12 Lee H， Dellatore S M， Miller W M， Messersmith P B. Science， 2007， 318（5489）: 426～430

13 Fu Y C， Li P H， Xie Q J， Xu X H， Lei L H， Chen C， Zou C， Deng W F， Yao S Z. Adv. Funct. Mater.， 2009， 19（11）: 1784～1791

14 Fei B， Qian B T， Yang Z Y， Wang R H， Liu W C， Mak C L， Xin J H. Carbon.， 2008， 46（13）: 1795～1797

15 Xu L Q， Yang W J， Neoh K G， Kang E T， Fu G D. Macromolecules， 2010， 43（20）: 8336～8339

16 Tung V C， Allen M J， Yang Y， Kaner R B. Nat. Nanotech.， 2009， 4（1）: 25～29

17 Hummers W， Offeman R. J. Am. Chem. Soc.， 1958， 80（6）: 1339

18 Kovtyukhova N I， Ollivier P J， Martin B R， Mallouk T E， Chizhik S A， Buzaneva E V， Gorchinskiy A D. Chem. Mater.， 1999， 11（3）: 771～778

19 Zheng L Z，Yao X， Li J H. Curr. Anal. Chem.， 2006， 2（3）: 279～296

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Preparation of H2O2 Biosensor Based on

Graphenepolydopamine Nanomaterials

ZHENG LongZhen*， LI YinDi， XIONG LeYan， LIU Wen， LIU Qiang， HAN Kui， YANG ShaoMing， XIA Jian

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（Department of Chemistry and Chemical Engineering， East China Jiao Tong University， Nanchang 330013）

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Abstract A novel graphenepolydopamine nanomaterial with biomimetic functions was synthesized. The graphenepolydopamine nanomaterial was applied in the fabrication of H2O2 biosensors by using hydroquinone as electron mediator. The modified electrode exhibited good electrocatalytical activity to H2O2. The linear range was from 5.0×10－7 to 3.3×10－4 mol/L with a detection limit of 3.7×10－7 mol/L （S/N＝3） and the linear correlation coefficient was 0.9995.

Keywords Polydopamine; Graphene; Hydroquinone; Horseradish peroxidase; Hydrogen peroxide

（Received 31 March 2011; accepted 21 June 2011）