超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定飼料中9種雄性激素類藥物

摘 要 建立了超高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLCQTOFMS）分析動(dòng)物飼料中違禁添加的去氫睪酮（BOL）、表睪酮（epiAn）、氟甲睪酮（FT）、去氫甲睪酮（美雄酮）（MD）、甲睪酮（MT）、丙酸諾龍（NP）、諾龍（N）、丙酸睪酮（TP）和睪酮（T）9種藥物的分析方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯振蕩提取，再用基質(zhì)固相萃取方法凈化處理后，采用UPLCQTOFMS分析檢測(cè)。在電噴霧正離子模式和飛行時(shí)間模式下，輸入各化合物的精確分子離子質(zhì)量數(shù)得到相應(yīng)的提取離子色譜圖，以色譜峰面積進(jìn)行定量分析。通過碰撞誘導(dǎo)解離模式（CID）得到各化合物碎片離子的精確質(zhì)荷比，進(jìn)一步對(duì)各化合物進(jìn)行定性分析。各化合物的質(zhì)量精確度均小于5 ×10－6，9種化合物在0～1000g/kg。3個(gè)添加水平（LOQ， 2LOQ， 4LOQ）的回收實(shí)驗(yàn)表明，化合物的回收率在70.0%～99.7%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于10%。本方法的定性準(zhǔn)確度明顯高于文獻(xiàn)報(bào)道的方法，可用于飼料中的禁用雄性激素藥物的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 液相色譜； 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜；飼料；雄性激素

1 引 言

雄性激素是一類生物體內(nèi)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)機(jī)體代謝或生理功能的物質(zhì)，在養(yǎng)殖業(yè)中用于促進(jìn)動(dòng)物生長、提高蛋白轉(zhuǎn)化率，以達(dá)到大幅度提高動(dòng)物養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的目的。研究表明，雄性激素藥物可通過飼料進(jìn)入到動(dòng)物組織，間接被人體攝入后，殘留的雄性激素會(huì)干擾人體內(nèi)自然激素的平衡，引起婦女出現(xiàn)類似早孕的反應(yīng)以及乳房腫脹、不規(guī)則出血等，影響肝臟功能，導(dǎo)致新生兒畸形，并且使人體患癌癥的幾率大大提高。因此，歐盟95/22/EC 規(guī)定禁止在飼料中使用雄性激素藥物。我國也頒布了相關(guān)的法律，禁止在飼料中使用雄性激素類藥物，但是違規(guī)使用的案例仍時(shí)有發(fā)生。因此，發(fā)展一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法很有必要。

常用的雄性激素的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）^[1]、氣相色譜法（GC）^[2，3]、氣相色譜質(zhì)譜法（GCMS）^[4～6]、液相色譜法（HPLC）^[7]、液相色譜質(zhì)譜法（LCMS）^[8，9]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS）^{[10，11]}等。ELISA、GC和HPLC的方法靈敏度較低， 選擇性和特異性較差， 已經(jīng)不適于雄性激素痕量殘留分析的要求。GCMS， LCMS和LCMS/MS雖然方法靈敏度和特異性都比較高， 但是，由于難以完全闡明化合物的結(jié)構(gòu)裂解信息，定性準(zhǔn)確度方面尚有欠缺，容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（QTOF）技術(shù)可對(duì)化合物進(jìn)行精確分子質(zhì)量的測(cè)定，并依據(jù)所測(cè)得的化合物的精確分子質(zhì)量對(duì)其進(jìn)行確證分析，同時(shí)在碰撞誘導(dǎo)解離（CID）模式下，得到化合物及其碎片離子的分子式和精確分子質(zhì)量，可進(jìn)一步對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律加以確證，定性準(zhǔn)確性很高。目前，尚未有應(yīng)用QTOF分析雄性激素的文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究采用超高效液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了動(dòng)物飼料中雄性激素的精確分析方法。優(yōu)化了前處理方法和色譜質(zhì)譜條件，建立了動(dòng)物飼料中去氫睪酮、表睪酮、氟甲睪酮、去氫甲睪酮（美雄酮）、甲睪酮、丙酸諾龍、諾龍、丙酸睪酮和睪酮共9種違禁添加的雄性激素定性確證方法和定量測(cè)定方法。9種雄性激素的結(jié)構(gòu)式見圖1。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

ACQUIT Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀， Synapt Q/TOF四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Waters公司）；均質(zhì)器；超聲器；振蕩器；離心機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

甲醇、乙酸乙酯（HPLC級(jí)， Fisher科技公司）；甲酸（純度49%～51%）；N丙基乙二胺吸附劑（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18封端，粒徑范圍為40～60m，平均孔徑100 nm，博納艾杰爾科技有限公司）；無水MgSO4（分析純）500 ℃灼燒4 h，置于干燥器中備用；9種雄性激素（去氫睪酮、表睪酮、氟甲睪酮、去氫甲睪酮、甲睪酮、丙酸諾龍、諾龍、丙酸睪酮和睪酮）標(biāo)準(zhǔn)品均購于Sigma公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（Millipore公司）。

2.2 樣品前處理

稱取飼料試樣2 g （精確到0.01 g），置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL水，高速均質(zhì)1 min，水浴超聲5 min，取出樣品靜置，使其溫度降至室溫。加入15 mL乙酸乙酯，水平振蕩提取10 min，于5 ℃，10000 r/min條件下離心5 min。收集上清液于另一個(gè)50 mL具塞離心管中。在剩余混合物中分兩次分別加入15和10 mL乙酸乙酯，重復(fù)振蕩、提取和離心，合并3次上清液于離心管中，從中移取10 mL至另一個(gè)25 mL離心管，待凈化。

準(zhǔn)確稱取400 mg PSA， 50 mg C18和600 mg無水MgSO4，一次性加入裝有10 mL樣品提取液的離心管中，迅速高速渦旋1 min，于5 ℃，10000 r/min條件下離心5 min。吸取所有有機(jī)相溶液，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，40 ℃減壓蒸發(fā)至近干。加入2.0 mL 20%（V/V）甲醇溶解濃縮物，渦旋混合1 min，過0.22m濾膜，供超高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定。

電噴霧離子源（ESI）：正離子模式；毛細(xì)管電壓3 kV；錐孔電壓35 V；萃取錐孔電壓4 V；脫溶劑氣溫度350 ℃；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣流速350 L/h；錐孔氣流速20 L/h；四極桿采集質(zhì)量數(shù)范圍 50～1000 U。數(shù)據(jù)采集模式：棒狀（Centroid）；掃描采集時(shí)間0.5 s；TOF運(yùn)行模式：V 模式。L亮氨酸腦啡肽（LE）；采集時(shí)間1 s；采集間隔時(shí)間10 s；掃描精確質(zhì)量數(shù)554.2615（負(fù)離子模式）。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)，因此流動(dòng)相的組成和添加劑除了影響分析物的保留時(shí)間和峰形外，還會(huì)影響到分析物的離子化效率，從而影響到目標(biāo)化合物的檢測(cè)靈敏度。本實(shí)驗(yàn)分別采用甲醇0.1%甲酸，乙腈0.1%甲酸作為流動(dòng)相，考察流動(dòng)相組成對(duì)于各化合物響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，以甲醇0.1%甲酸作為流動(dòng)相時(shí)，儀器響應(yīng)值高于乙腈0.1%甲酸為流動(dòng)相時(shí)的響應(yīng)值，并且可以獲得更好的峰形和分離效果，因此以甲醇0.1%甲酸作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相，圖1為100

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過對(duì)單個(gè)分析物標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，確定各目標(biāo)分析物的準(zhǔn)分子離子峰，并分別優(yōu)化其錐孔電壓，通過MassLynx 軟件中Elemental Composition功能的分析得到目標(biāo)分析物的精確分子量，并且可以得到元素組成分析和目標(biāo)分析物的質(zhì)量精確度。根據(jù)分析物自身分子式和電噴霧正離子模式加H的機(jī)理，選擇與目標(biāo)分子式相匹配的元素組成，并且質(zhì)量精確度范圍絕對(duì)值均小于5×10–6，則所測(cè)得的質(zhì)量數(shù)為該目標(biāo)分析物的 \\＋精確分子量。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，在質(zhì)量精確度絕對(duì)值小于5×10－6，均可對(duì)該化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定性分析。分別以其準(zhǔn)分子離子為母離子，通過氬氣碰撞產(chǎn)生碎片離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，同時(shí)優(yōu)化碰撞能量，選擇豐度較高的2種碎片離子作為定性與定量特征離子，最大程度提高檢測(cè)的靈敏度。表1為各化合物的精確分子量，理論分子量和質(zhì)量精確度，這3種化合物的質(zhì)量精確度絕對(duì)值在0.9×10－6～3.8×10－6之間。表2為各化合物的特征離子及其優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)。經(jīng)過分析，每種藥物都得到一個(gè)準(zhǔn)分子離子和兩個(gè)特征離子的精確質(zhì)量數(shù)，可以更為精確的定性。根據(jù)歐盟2002/657/EC的規(guī)定，每個(gè)高分辨離子可以得到2分，因此，本方法的定性準(zhǔn)確度很高，可得到高達(dá)6分的判定。與一般LCMS/MS方法的4分相比，有較大提升，可以有效避免采用LCMS/MS等方法造成的假陽性等結(jié)果。

3.3 樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除

基質(zhì)效應(yīng)是指當(dāng)色譜分離時(shí)共洗脫的物質(zhì)改變了待測(cè)組分的離子化效率，所引起信號(hào)的提高或抑制。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)影響大時(shí)，會(huì)降低方法的靈敏度，影響方法的準(zhǔn)確性。為最大限度消除基質(zhì)效應(yīng)干擾，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配法進(jìn)行定量分析。以空白飼料樣品的提取液為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，可使標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液具有相同的離子化環(huán)境，從而消除基質(zhì)效應(yīng)。

3.4 線性關(guān)系和精密度

在本儀器的高分辨模式下，分析物的質(zhì)量數(shù)可以精確到小數(shù)點(diǎn)的后3位，由此可以得到各分析物的分子離子的精確質(zhì)量數(shù)。在總離子流色譜圖（TIC）上，通過輸入各分析物精確分子離子質(zhì)量數(shù)，得到提取離子色譜圖。通過提取離子色譜圖的峰面積積分y，對(duì)相應(yīng)分析物濃度x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量分析。

g/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。以定量離子對(duì)3倍信噪比（S/N）的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的樣品濃度作為儀器方法的檢出限（LOD）。通過添加標(biāo)準(zhǔn)品配制一定濃度的飼料樣品，經(jīng)前處理和檢測(cè)后，以S/N＝10時(shí)為分析方法的定量限（LOQ）， 其線性方程、相關(guān)系數(shù)、儀器檢出限（LOD）和方法定量限（LOQ）見表3。

3.5 回收率和精密度

在飼料樣品中分別添加不同水平的9種雄性激素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按前述實(shí)驗(yàn)方法及條件進(jìn)行回收率測(cè)定。在LOQ， 2LOQ和4LOQ的添加水平下，化合物的回收率在70.0%～99.7%范圍內(nèi)；重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。精密度和回收率測(cè)定結(jié)果見表4。

3.6 實(shí)際樣品篩查

從重慶、深圳市場(chǎng)上購得10種谷物飼料樣品，按照上述方法進(jìn)行篩查，再通過MassLynx 軟件中的Mass Chromatogram功能，在樣品的總離子流圖中輸入各化合物的精確分子量，以提取這些化合物，結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)9種目標(biāo)激素殘留。

實(shí)驗(yàn)表明，本研究所建立的四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析雄性激素的方法準(zhǔn)確度明顯高于其它分析方法，能夠更好地滿足歐盟等發(fā)達(dá)國家和組織對(duì)食品中殘留藥物的定性要求，可有效避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，在食品安全控制中具有很好的實(shí)用性。

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Simultaneous Determination of Nine Androgen Drugs in Feeds by

UltraPerformance Liquid ChromatographyQuadrupole

TimeofFlight Mass Spectrometry

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ZHANG Feng1， XU ChengBao1，2， LAN Fang3， WANG XiuJuan1，

YONG Wei1， SUO Ran2， CHU XiaoGang*1， DING Fei1， 4， L QuanFu1，5

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1（Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100123）

2（College of Food Science and Technology， Agriculture University of Hebei， Baoding 071001） 

3（Shenzhen EntryExit Inspection and Quarantine Burea， Shenzhen 518033）

4（College of Pharmaceutical Sciences， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053） 

5（College of Pharmaceutical Sciences， Southwest University， Chongqing 400715）

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Abstract An ultraperformance liquid chromatography （UPLC） quadrupoletimeofflight mass spectrometric （QTOFMS） method was developed for determination of 9 androgen drugs in feeds. After homogenization， the samples were extracted with ethyl acetate， and then the extracts were directly purified with matrix solid phase extraction. Identification and detection were achieved in the positive electrospray ionization （ESI） mode using QTOFMS. The extracted ion chromatograms of each compound were obtained by entering the accurate molecular mass. The samples were quantified with the chromatographic peak area of each compound. The potential of UPLCQTOF MS for confirmatory analysis was shown by determining the accurate mass of all compounds and fragment ions upon collisioninduceddissociation （CID） at different energies. The extra mass measurements errors for all androgen drugs were found to be within 5 ×10－6. For these drugs， the calibration curves were linear between 0 to 1000 g/L， and the correlation coefficient was more than 0.99. The recoveries for all compounds in feeds were 70.0%－99.7% at the fortified levels of 1LOQ， 2LOQ and 4LOQ with the limit of quantitation （LOQ） of 16， 10， 20， 43， 20， 12， 15， 10 and 16g/kg. The relative standard deviations （RSD） for all compounds were less than 10%.

Keywords Ultra performance liquid chromatography; Quadrupoletimeofflight mass spectrometry; Feeds; Androgen drugs 

（Received 3 May 2011; accepted 7 August 2011）