質(zhì)譜智能選擇反應(yīng)監(jiān)測用于蛋白質(zhì)絕對定量中母子離子對確證的方法研究

摘 要 質(zhì)譜選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）技術(shù)在蛋白質(zhì)絕對定量分析中的應(yīng)用越來越廣泛，其成功應(yīng)用的關(guān)鍵是肽段母子離子對的正確選擇與確證。觸發(fā)采集二級圖譜是目前常用的母子離子對確認方法，但分析效率有待于提高。質(zhì)譜智能選擇反應(yīng)監(jiān)測（iSRM）是新近發(fā)展的高通量分析方法。為了考察該方法用于通量化母子離子對確證時的效果，選用牛血清白蛋白（BSA）和酵母蛋白提取物作為樣品進行分析。結(jié)果表明，該方法具有更高的分析靈敏度，可以對低至1 fmol BSA樣品中的母子離子對進行確證，而且相對于觸發(fā)采集二級圖譜方法而言，具有更高的分析通量，為規(guī)?；缸与x子對選擇與確證提供了一種新的策略。

關(guān)鍵詞 蛋白質(zhì)絕對定量；母子離子對；質(zhì)譜智能選擇反應(yīng)監(jiān)測

1 引 言

近年來，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)由定性研究向定量研究轉(zhuǎn)變^[1]，對蛋白質(zhì)進行絕對定量分析正成為一個研究熱點^[2～4]?；谫|(zhì)譜選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）技術(shù)的蛋白質(zhì)絕對定量方法也受到廣泛關(guān)注^[5]。該技術(shù)在三重四極桿第一級（Q1）和第三級（Q3）中分別選擇檢測特定母離子和子離子，在母離子和子離子兩個水平排除干擾，增強檢測特異性。同時結(jié)合同位素內(nèi)標，依據(jù)特定子離子和相應(yīng)內(nèi)標子離子峰面積的比值，實現(xiàn)對目標蛋白質(zhì)的絕對定量。然而，應(yīng)用SRM技術(shù)進行通量化蛋白質(zhì)組絕對定量時依然面臨一些挑戰(zhàn)。首先需要對肽段及其母子離子對進行高通量篩選；其次在定量分析時，由于樣品中雜質(zhì)信號的干擾，還需要對母子離子對進行高通量確認，以確保采集到的母子離子對信號真正來自于目標肽段。這些問題的解決均需要發(fā)展可以進行高通量母子離子對確認的方法。目前觸發(fā)采集二級圖譜是常用的方法^[6]，它通過采集部分母子離子對的信號，并在這些信號達到一定閾值時觸發(fā)采集二級圖譜，進行母子離子對確證。但采集二級質(zhì)譜往往需要較長的時間，降低了質(zhì)譜采集效率。

質(zhì)譜智能選擇反應(yīng)監(jiān)測（Intelligent SRM， iSRM）技術(shù)是新近出現(xiàn)的一種分析方法^[7]。為了提高分析通量，它將目標肽段的母子離子對分為主要的和次要的，分別對應(yīng)于信號較強的2～3個子離子和其余的子離子。質(zhì)譜采集時，只采集每個肽段中少量的主要母子離子對，因而在固定采集時間內(nèi)可以分析更多的肽段，提高了分析通量。當(dāng)采集的主要母子離子對信號達到一定閾值時，觸發(fā)采集次要母子離子對信號，在定量分析的同時實現(xiàn)對母子離子對的定性確證，提高了質(zhì)譜分析的效率。但該方法用于高通量母子離子對確認時的效果以及與觸發(fā)采集二級圖譜方法的效果差異均未見文獻報道。本研究選用一些蛋白樣品對此進行了考察。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑TSQ vantage質(zhì)譜系統(tǒng)（Thermo公司）；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin， BSA）、酵母（Saccharomyces cerevisiae） （Sigma公司）；胰蛋白酶、二硫蘇糖醇（Dithiotheitol， DTT， Promega公司）；碘乙酰胺（Iodoacetamide， IAA， New Jersey公司）；乙腈（J. T. Bake公司）；甲酸（Fluka公司）。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2 蛋白樣本制備 

BSA用50 mmol/L NH4HCO3溶液溶解后，加入DTT（終濃度10 mmol/L）于95 ℃水浴孵育10 min。再加入IAA（終濃度50 mmol/L），于室溫暗處反應(yīng)1 h。最后加入1∶50（胰酶∶底物）的胰酶，在37 ℃水浴中酶切過夜。

將200 mg酵母懸浮于1 mL含50 mmol/L NH4HCO3的裂解液中，在冰浴上超聲裂解（每超聲0.1 s，暫停2 s，重復(fù)100次）。室溫靜置30 min后，將裂解液在40，000 g下離心60 min，再將上清液于40000 g離心60 min。用Bradford法測定蛋白濃度為1.46 g/L。

在蛋白提取物（100 1 引 言

近年來，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)由定性研究向定量研究轉(zhuǎn)變^[1]，對蛋白質(zhì)進行絕對定量分析正成為一個研究熱點^[2～4]?；谫|(zhì)譜選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）技術(shù)的蛋白質(zhì)絕對定量方法也受到廣泛關(guān)注^[5]。該技術(shù)在三重四極桿第一級（Q1）和第三級（Q3）中分別選擇檢測特定母離子和子離子，在母離子和子離子兩個水平排除干擾，增強檢測特異性。同時結(jié)合同位素內(nèi)標，依據(jù)特定子離子和相應(yīng)內(nèi)標子離子峰面積的比值，實現(xiàn)對目標蛋白質(zhì)的絕對定量。然而，應(yīng)用SRM技術(shù)進行通量化蛋白質(zhì)組絕對定量時依然面臨一些挑戰(zhàn)。首先需要對肽段及其母子離子對進行高通量篩選；其次在定量分析時，由于樣品中雜質(zhì)信號的干擾，還需要對母子離子對進行高通量確認，以確保采集到的母子離子對信號真正來自于目標肽段。這些問題的解決均需要發(fā)展可以進行高通量母子離子對確認的方法。目前觸發(fā)采集二級圖譜是常用的方法^[6]，它通過采集部分母子離子對的信號，并在這些信號達到一定閾值時觸發(fā)采集二級圖譜，進行母子離子對確證。但采集二級質(zhì)譜往往需要較長的時間，降低了質(zhì)譜采集效率。

質(zhì)譜智能選擇反應(yīng)監(jiān)測（Intelligent SRM， iSRM）技術(shù)是新近出現(xiàn)的一種分析方法^[7]。為了提高分析通量，它將目標肽段的母子離子對分為主要的和次要的，分別對應(yīng)于信號較強的2～3個子離子和其余的子離子。質(zhì)譜采集時，只采集每個肽段中少量的主要母子離子對，因而在固定采集時間內(nèi)可以分析更多的肽段，提高了分析通量。當(dāng)采集的主要母子離子對信號達到一定閾值時，觸發(fā)采集次要母子離子對信號，在定量分析的同時實現(xiàn)對母子離子對的定性確證，提高了質(zhì)譜分析的效率。但該方法用于高通量母子離子對確認時的效果以及與觸發(fā)采集二級圖譜方法的效果差異均未見文獻報道。本研究選用一些蛋白樣品對此進行了考察。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑TSQ vantage質(zhì)譜系統(tǒng)（Thermo公司）；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin， BSA）、酵母（Saccharomyces cerevisiae） （Sigma公司）；胰蛋白酶、二硫蘇糖醇（Dithiotheitol， DTT， Promega公司）；碘乙酰胺（Iodoacetamide， IAA， New Jersey公司）；乙腈（J. T. Bake公司）；甲酸（Fluka公司）。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2 蛋白樣本制備 

BSA用50 mmol/L NH4HCO3溶液溶解后，加入DTT（終濃度10 mmol/L）于95 ℃水浴孵育10 min。再加入IAA（終濃度50 mmol/L），于室溫暗處反應(yīng)1 h。最后加入1∶50（胰酶∶底物）的胰酶，在37 ℃水浴中酶切過夜。

將200 mg酵母懸浮于1 mL含50 mmol/L NH4HCO3的裂解液中，在冰浴上超聲裂解（每超聲0.1 s，暫停2 s，重復(fù)100次）。室溫靜置30 min后，將裂解液在40，000 g下離心60 min，再將上清液于40000 g離心60 min。用Bradford法測定蛋白濃度為1.46 g/L。

在蛋白提取物（100 SymbolmA@

g，68.4 SymbolmA@

L）中加入25 SymbolmA@

L溶于50 mmol/L NH4HCO3的8 mol/L尿素溶液進行蛋白變性后，加入2.78 SymbolmA@

L 100 mmol/L DTT，在37 ℃水浴反應(yīng)4 h，再加入1.46 SymbolmA@

L 1 mol/L IAA在室溫暗處反應(yīng)1 h。用50 mmol/L NH4HCO3溶液稀釋，使脲的最終濃度小于1 mol/L后，加入胰酶-底物（1∶50）的胰酶，在37 ℃水浴中酶切過夜。酶解液濃縮后重溶于2%乙腈（含0.1%甲酸）中。



2.3 色譜-質(zhì)譜條件

Eksigent 2D液相系統(tǒng)（Eksigent公司）。在線脫鹽trap柱（u-Precolumn Cartridge，5.0 mm × 0.3 mm，戴安公司）。自制毛細管直噴柱（150 mm×75

m，金歐亞公司）。線性梯度為95% A相（2%乙腈、0.1%甲酸溶液）-50% B相（80%乙腈、0.1%甲酸溶液），梯度時間1 h， 流速300 nL/min。

觸發(fā)采集二級質(zhì)譜（Quantitation-enhanced data-dependent MS/MS， QED MS/MS）和iSRM采集方法：均為正離子模式，噴射電壓均為2.1 kV，毛細管溫度均為200 ℃，Q1和Q3分辨率設(shè)置均為0.7 （FWHM），Q2碰撞氬氣壓力均為19.03 Pa，觸發(fā)閾值設(shè)定均為100，碰撞能量（CE）均按如下公式計算：CE＝（0.034×母離子的質(zhì)荷比）＋2.314。QED方法的Cycle time設(shè)置依母子離子對數(shù)量而定，觸發(fā)二級質(zhì)譜采集時間設(shè)置為1 s；iSRM方法Cycle time設(shè)置為2 s，觸發(fā)iSRM采集時間設(shè)置為0.1 s。 

2.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均由Pinpoint 1.0 （Thermo公司）進行分析。QED方法中觸發(fā)的二級質(zhì)譜進行手工分析，與理論裂解碎片比對以進行母子離子對的確證。iSRM方法中觸發(fā)的iSRM圖譜由Pinpoint軟件分析后再進行手工確證，以保證確證的母子離子對的可靠性。

3 結(jié)果與討論

3.1 iSRM方法用于母子離子對確證

為了考察iSRM方法用于母子離子對確證的效果，以1 pmol BSA酶切肽段為樣品進行分析。其中肽段VPQVSTPTLVEVSR（m/z 756.87）的iSRM分析結(jié)果如圖1。圖1a是采集該肽段主要母子離子對得到的總離子流（TIC）圖譜，在液相保留時間29.09 min之前，質(zhì)譜只對其主要母子離子對進行采集。臨近29.09 min時，肽段被洗脫下來，采集到的主要母子離子對信號強度均達到了閾值，觸發(fā)質(zhì)譜再采集其次要母子離子對信號，采集的質(zhì)譜圖如圖1b。此時質(zhì)譜采集到的信號構(gòu)成合成二級圖譜（Composite MS/MS spectrum），將此圖譜與該肽段的二級圖譜進行比對^[8]，即可用于此肽段的確證。結(jié)果表明，應(yīng)用iSRM方法可以對此肽段進行有效的確證。

圖1 1 pmol BSA酶切肽段VPQVSTPTLVEVSR（m/z 756.87）的iSRM分析圖譜

Fig．1 Intelligent selected rection monitoring （iSRM） spectrum of VPQVSTPTLVEVSR（m/z 756.87） from 1 pmol BSA digest

a. 采集primary母子離子對得到的圖譜；b. 觸發(fā)采集的所有母子離子對信號。 a． Spectrum of primary transitions; b. Triggered acquisition of all transitions.

要成功利用iSRM方法進行母子離子對的確證，還需確定合適的主要母子離子對和觸發(fā)閾值。合適的主要母子離子對的確定除了可以結(jié)合Pinpoint軟件預(yù)測之外，還需要進行反復(fù)的實驗驗證。而觸發(fā)閾值則可以根據(jù)質(zhì)譜分析時的基線強度作為指標確定。經(jīng)過反復(fù)實驗，共有13個BSA非冗余肽段的母子離子對能夠被有效確證（如表1）。

3.2 iSRM方法與QED方法的比較

為了比較iSRM方法與QED方法用于母子離子對確證時的效果差異，同樣對1 pmol BSA酶切肽段進行QED分析。其中肽段VPQVSTPTLVEVSR（m/z 756.87）的QED分析結(jié)果如圖2。圖2a是采集其

3個母子離子對（經(jīng)Pinpoint軟件預(yù)測信號最強的3個）的TIC圖譜。同樣，在液相保留時間29.96 min之前，只對這些母子離子對進行采集。臨近29. 96 min肽段被洗脫時，采集到的這些母子離子對信號強度均達到閾值，觸發(fā)質(zhì)譜采集其MS/MS圖譜（如圖2b）。將此MS/MS圖譜中的質(zhì)譜峰與該肽段的理論碎片離子進行比對，同樣可以對此肽段進行有效的確證。

比較圖1和圖2可知，在同樣液相條件下分析同一肽段時，iSRM方法確證的液相保留時間與QED方法確證的液相保留時間近似，而且iSRM分析產(chǎn)生的合成二級圖譜與QED分析產(chǎn)生的二級圖譜中，質(zhì)譜峰信號均對應(yīng)于該肽段的理論碎片離子，由此認為這兩種方法均可以用于該肽段母子離子對的確證。

3.3 分析靈敏度考察

為了考察對低豐度蛋白樣品的分析能力，選用1 fmol BSA酶切肽段樣品分別進行iSRM和QED分析。其中肽段LVTDLTK（m/z 395.473）的iSRM分析結(jié)果如圖3。利用iSRM方法可以對該肽段母

圖2 1 pmol BSA酶切肽段VPQVSTPTLVEVSR（m/z 756.87）的QED分析圖譜

Fig．2 Quantitation-enhanced data-dependent （QED） spectrum of VPQVSTPTLVEVSR（m/z 756.87） from 1 pmol BSA digest

a.采集預(yù)設(shè)母子離子對得到的圖譜；b. 觸發(fā)采集的MS/MS圖譜。a． Spectrum of pre-set transitions; b. Triggered MS/MS acquisition.

子離子對進行有效確證（圖3b）。該肽段的QED分析結(jié)果如圖4。從圖4可見，雖然也能獲得較好的SRM譜圖（圖4a），但在觸發(fā)采集的所有MS/MS圖譜中（圖4b），質(zhì)譜峰信號均未能與該肽段的理論碎片離子匹配，也就不能用來確證該肽段。而且，通過對其它肽段的QED分析，也沒有一個肽段的母子離子對能被有效確證。這說明即使對于低濃度的BSA蛋白樣品，采用iSRM的方法也可以對其中的肽段母子離子對進行有效確證與分析，而采用QED方法則無法實現(xiàn)這種分析。

圖3 1 fmol BSA酶切肽段LVTDLTK（m/z 395.473）的iSRM分析圖譜

Fig．3 iSRM spectrum of LVTDLTK（m/z 395.473）from 1 fmol BSA digest

a. 采集primary母子離子對得到的圖譜；b. 觸發(fā)采集的所有母子離子對信號。a． Spectrum of primary transitions; b. Triggered acquisition of all transitions.

圖4 1 fmol BSA酶切肽段LVTDLTK（m/z 395.473）的QED分析圖譜

Fig．4 QED spectrum of LVTDLTK（m/z 395.473）from 1 fmol BSA digest 

a. 采集預(yù)設(shè)母子離子對得到的圖譜；b. 觸發(fā)采集的MS/MS圖譜。a. Spectrum of pre-set transitions;

b. Triggered MS/MS acquisition.

這表明，采用iSRM方法能獲得比采用QED方法更高的分析靈敏度，這與iSRM方法具有更高的采集效率有關(guān)。在iSRM分析時，通過將母子離子對進行分類，既保證了對每個肽段都有足夠的分析時間，提高了靈敏度；又可以同時對其進行定性確證，提高了采集效率，有利于提高對低豐度蛋白樣品的分析能力。

3.4 分析通量考察

為了考察在分析復(fù)雜蛋白樣品時的通量，選用酵母蛋白提取物作為樣品。在1 g酵母蛋白提取物酶切肽段直接進行nanoLC-LTQ-FT MS/MS分析后得到的鑒定結(jié)果中，利用Pinpoint軟件選擇128個蛋白質(zhì)，對應(yīng)202個肽段，作為待分析目標蛋白質(zhì)肽段。分別對同樣1 g的酵母蛋白提取物酶切肽段直接進行iSRM和QED分析。iSRM分析時，共包含1608個母子離子對。經(jīng)過5次重復(fù)實驗，均能被有效確證的蛋白有46個，對應(yīng)69個肽段，結(jié)果見表2。QED分析時，共包含606個母子離子對。而能被有效確證的蛋白僅有11個，對應(yīng)15個肽段（表2中上標a的肽段）。這表明在分析復(fù)雜蛋白樣品時，iSRM方法比QED方法具有更高的確證效率，也再次表明通過將母子離子對進行分類的辦法，確實能在固定采集時間內(nèi)分析更多的肽段，從而對更多的母子離子對進行有效確證，也就能夠保證對更多的蛋白質(zhì)進行定量分析。

對表2中被確證的酵母蛋白豐度進行分析。結(jié)果表明，iSRM方法比QED方法具有更寬的分析范圍。利用iSRM方法確證的酵母蛋白，最高豐度為1.02×106拷貝/細胞，最低豐度低于50拷貝/細胞。采用QED方法雖然也可以對一定豐度范圍（≥3.77×102拷貝/細胞）的目標蛋白進行有效確證，但效率低很多，尤其對于低豐度蛋白的確證分析，更不及iSRM方法。因此，采用iSRM方法可以對更寬豐度范圍內(nèi)更多的目標蛋白進行有效確證，尤其是對低豐度的蛋白也可以進行有效確證，十分適合于進行規(guī)?；哪缸与x子對選擇與確證。

4 結(jié) 論

本研究選用牛血清白蛋白和酵母蛋白提取物作為樣品，利用質(zhì)譜智能選擇反應(yīng)監(jiān)測（iSRM）技術(shù)作為蛋白質(zhì)絕對定量分析中肽段母子離子對的確證方法。結(jié)果表明，與常用的觸發(fā)采集二級圖譜的確證方法相比，iSRM方法可以對更寬豐度范圍內(nèi)更多的目標蛋白質(zhì)肽段及其母子離子對進行有效確證分析，為規(guī)?；哪缸与x子對選擇與確證提供了一種新的策略。

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Validation of Transitions by Intelligent Selected Reaction Monitoring-

Mass Spectrometry for Protein Absolute Quantitation

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WEI Jun-Ying1， 2， ZHANG Yang-Jun2， ZHAO Yan2， CHEN Xi-Shu3，

MA Yan2， YING Wan-Tao2， QIAN Xiao-Hong*2



1（Department of Life Science， Beijing Institute of Technology， Beijing 100081）

2（State Key Laboratory of Proteomics， Beijing Proteome Research Center，

Beijing Institute of Radiation Medicine， Beijing 102206）

3（ThermoFisher Scientific （China）， Shanghai 201206）



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Abstract Selected reaction monitoring （SRM）-mass spectrometry is increasingly applied to absolute quantitation of proteins. In large scale quantitative analyses， one of the main challenges is that the initial set of transitions should be optimized and validated to ensure that the quantified signals indeed derive from the targeted peptide. SRM-triggered MS/MS acquisition is an efficient way for validation， but still needs improvement. Recently， an innovative intelligent SRM （Isrm） was introduced to alleviate the challenge. In this study， iSRM was tested to validate the transitions of peptides of bovine serum albumin （BSA） and yeast proteins. The experimental results show that the method has increased selectivity and throughput for validation of transitions of peptides. Even for 1 fmol BSA， a set of transitions can be successfully validated， indicating that iSRM method is suitable for large scale validation of transitions of peptides in quantitative proteomics research.

Keywords Protein absolute quantitation; Transition; Intelligent selected reaction monitoring

（Received 28 March 2011; accepted 22 May 2011）