多壁碳納米管和分子印跡膜修飾電極檢測(cè)豬尿液中萊克多巴胺

摘 要 采用原位熱聚合技術(shù)，分別以多壁碳納米管（MWCNs）和分子印跡膜（MIM）修飾絲網(wǎng)印刷電極（SPE），與多壁碳納米管和非分子印跡膜（NIM）修飾的絲網(wǎng)印刷電極組合在一起，并將其組合的絲網(wǎng)印刷電極通過(guò)電極插口與便攜式電導(dǎo)儀相連接，組裝成檢測(cè)萊克多巴胺殘留的電導(dǎo)型傳感器，優(yōu)化檢測(cè)條件，并建立了檢測(cè)萊克多巴胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 測(cè)試了實(shí)際豬尿樣中萊克多巴胺的含量。通過(guò)掃描電鏡分析了該分子印跡膜的表征結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明， 在萊克多巴胺分子印跡膜表面形成了大量印跡微孔。本傳感器裝置檢測(cè)萊克多巴胺具有很高的靈敏度和特異性，檢出限為0.033 mg/L，線性范圍為0.33～8.0 mg/L，基于豬尿樣的檢測(cè)回收率達(dá)到91%～98%，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 多壁碳納米管； 萊克多巴胺； 分子印跡膜； 電導(dǎo)型傳感器

1 引 言

萊克多巴胺（RAC）是苯乙醇胺類(lèi)β2腎上腺素興奮劑，能夠顯著提高動(dòng)物胴體的瘦肉率和降低體內(nèi)脂肪的沉積率^[1～5]。然而，當(dāng)人們食用含有萊克多巴胺等一些促生長(zhǎng)興奮劑的肉類(lèi)食物后，會(huì)在人體內(nèi)殘留，嚴(yán)重危害人體健康和生命安全。因此，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家和組織都禁止在動(dòng)物性飼料中添加萊克多巴胺，并對(duì)萊克多巴胺在動(dòng)物組織中的最大殘留限量（Maximal residue limits， MRL）做出了明確規(guī)定。其中，世界衛(wèi)生組織食品添加劑專(zhuān)家聯(lián)席委員會(huì)（JECFA）規(guī)定在肝臟、腎臟、肌肉中MRL分別為40，90和10 ng/g。研發(fā)高效檢測(cè)萊克多巴胺的新方法是控制萊克多巴胺濫用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前，萊克多巴胺的常用檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫親和柱層析法、色譜分析方法和傳感器方法等^[6～16]。上述檢測(cè)方法雖然準(zhǔn)確、靈敏，但樣品前處理及操作過(guò)程繁瑣，費(fèi)用昂貴，不適宜于現(xiàn)場(chǎng)大量篩選。因此，有必要研制出高效和快速檢測(cè)萊克多巴胺的方法。分子印跡聚合物 （Molecularly imprinted polymers， MIP）和MIM對(duì)目標(biāo)化合物具有高度選擇性，在樣品的分離、富集、檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用^[16～20]。有關(guān)利用分子印跡膜為感受器檢測(cè)豬尿中電導(dǎo)型傳感方法的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用原位熱聚合技術(shù)，將多壁碳納米管（MWCNs）和分子印跡膜依次修飾在絲網(wǎng)印刷電極上，再將絲網(wǎng)印刷電極通過(guò)電極插口與便攜式電導(dǎo)儀相接，組裝成檢測(cè)萊克多巴胺殘留的電導(dǎo)型傳感器。通過(guò)更換帶有印跡膜的電極條，將待測(cè)樣品直接滴入電極條工作區(qū)， 即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品的快速檢測(cè)。此電導(dǎo)型傳感器具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快和成本低等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

FEI SIRION200型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（美國(guó)FEI公司）； XMTD204電熱恒溫水浴鍋（上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；索氏提取器（江蘇海門(mén)華盛實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SB80超聲波儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；臺(tái)式高速離心機(jī) （北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；CON 6/TDS 6 電導(dǎo)儀（新加坡OAKTON公司）；一次性絲網(wǎng)印刷電極條（臺(tái)灣芯寶科技股份有限公司）。m，純度＞99%，Sigma公司）；甲基丙烯酸（MAA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯 （EGDMA，Sigma公司）、偶氮二異丁腈 （AIBN，Sigma公司）、HNO3、二氯亞砜 （SOCl2）、H2O2、H2SO4、醋酸、醋酸鈉、甲醇和乙醇等均購(gòu)于上海醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，上述試劑均為分析純?cè)噭?。伯瑞坦羅比森緩沖溶液（BR buffer）以H3PO4、乙酸、硼酸配制；碳酸鹽緩沖液以無(wú)水碳酸鈉和NaHCO3配制；TrisHCl緩沖液；PBS緩沖液以NaH2PO4和Na2HPO4配制; 醋酸鹽緩沖液以醋酸鈉和醋酸配制。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

2.2 多壁碳納米管修飾絲網(wǎng)印刷電極

取未經(jīng)過(guò)處理的多壁碳納米管0.30 g， 加入0.30 mL甲醇，超聲1 h后，可以看到多壁碳納米管均勻稀釋在甲醇溶液中。絲網(wǎng)印刷電極的基本結(jié)構(gòu)是在PVC基板上按設(shè)計(jì)圖案印制導(dǎo)電銀漿層、導(dǎo)電碳漿層及絕緣層。絲網(wǎng)印刷電極在使用前用20% H2SO4和10% H2O2在玻璃器皿中清洗30 min，然后再用蒸餾水反復(fù)清洗3次，使其表面干凈，將其自然晾干，于－4 ℃保存?zhèn)溆?。?/p>

2.3 印跡膜（MIM）和非印跡膜（NIM）的制備

取0.033 g 萊克多巴胺（模板分子）和0.034 mL MAA溶于0.670 mL二甲亞砜中，超聲10 min，放置2 h進(jìn)行預(yù)聚合。再加入0.310 mL EGDMA和0.030 g AIBN，超聲混合均勻，充氮?dú)獬?0 min，留作備用。取0.6 L的上述聚合液均勻涂布在絲網(wǎng)印刷電極工作區(qū)，將電極條固定在玻璃皿中，抽真空后置于60 ℃的水浴鍋中熱聚合24 h后，取出電極條置于－4 ℃冰箱中冷卻、保存2 h，可以看到絲網(wǎng)印刷電極上涂布的聚合液區(qū)域出現(xiàn)半透明蠟狀物質(zhì)，即得到萊克多巴胺分子印跡膜（MIM）修飾的絲網(wǎng)印刷電極。用甲醇/乙酸（9∶1， V/V）溶液洗脫48 h，用甲醇洗去乙酸，于－4 ℃保存?zhèn)溆?sup>[16]。

帶有非印跡膜（NIM）的絲網(wǎng)印刷電極條的制作方法同上，區(qū)別在于聚合過(guò)程中不加入模板分子。

2.4 傳感檢測(cè)方法的建立

修飾的絲網(wǎng)印刷電極示意圖如圖1所示，將修飾有MWCNs與MIM的絲網(wǎng)印刷電極條與修飾有MWCNs與NIM的絲網(wǎng)印刷電極條通過(guò)兩塊加樣控制擋板粘合為一體，兩電極工作區(qū)之間的間隙組成測(cè)試樣品加樣區(qū)，然后將組裝好的測(cè)試電極通過(guò)USB接口與電導(dǎo)儀相連（圖2）。

圖1 基于多壁碳納米管和分子印跡膜修飾的絲網(wǎng)印刷電極結(jié)構(gòu)圖

Fig．1 Fabrication of screen printed electrode （SPE） modified with multiwalled carbon nanotubes （MWCNs） and molecularly imprinted membrane （MIM）

Ⅰ. 絲網(wǎng)印刷電極（SPE）； Ⅱ. 多壁碳納米管修飾的電極條（SPE coated by MWCNs）； Ⅲ. 多壁碳納米管和分子印跡膜修飾的電極條（SPE modified by MWCNs and MIM）； Ⅳ. 洗脫后的電極條（SPE after elusioning）； Ⅴ. 電導(dǎo)儀探針（conductometric probe）。 1. 接線頭端子（Terminal post）； 2. 導(dǎo)電軌 （Conductor rail）； 3. 絕緣層 （Insulation layer）； 4. 工作區(qū) （Working area）； 5. 多壁碳納米管 （MWCNs）； 6. 分子印跡膜 （MIM）； 7. 洗脫后的分子印跡膜 （MIM after elusioning）； 8. 印跡膜的電極條 （SPE with MIM）； 9. 非印跡膜的電極條（SPE with nonimprinted membrane（NIM））；10. 測(cè)試區(qū)（Testing area）。L濃度為 10， 15， 25， 50， 100， 150和240 mg/L萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成含0.33， 0.50， 0.83， 1.67， 3.33， 5.00和8.00 mg/L萊克多巴胺的測(cè)試液。將絲網(wǎng)印刷電極的工作區(qū)浸入到緩沖液中，待傳感儀讀數(shù)穩(wěn)定后，記錄此刻電導(dǎo)值（背景值），加入待測(cè)樣品，穩(wěn)定后記錄電導(dǎo)值（終值）。每次檢測(cè)結(jié)束后更換帶有修飾的絲網(wǎng)印刷電極條，共測(cè)試7個(gè)濃度，平行測(cè)定3次。以扣除背景值的響應(yīng)信號(hào)值為縱坐標(biāo)，以不同濃度萊克多巴胺為橫坐標(biāo)，繪制曲線。

圖2 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)裝置示意圖

Fig．2 Schematic structure of analytical system

1. TrisHCl緩沖液（TrisHCl buffer）； 2. 磁力攪拌器（Magnetic stirrer）； 3. 電導(dǎo)儀（Conductometer）。

3 結(jié)果與討論

3.1 MIM和NIM的特征性分析

NIM對(duì)目標(biāo)分子具有一定的非特異性吸咐作用^[21]，本實(shí)驗(yàn)采用FEI SIRION200型發(fā)射掃描電鏡對(duì)隨機(jī)選取數(shù)個(gè)制備好的MIM和NIM進(jìn)行表征分析，拍攝的掃描照片如圖 3所示。從圖3A中可清晰地看出有很多凹痕，少量凹痕處出現(xiàn)直徑約20～30 nm的孔隙，可能是由于模板分子被洗脫后而遺留的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與分子印跡膜對(duì)模板分子的識(shí)別和吸附作用密切相關(guān)。但也有少量印跡物成團(tuán)聚集在一起，這可能是由于聚合分子在聚合結(jié)束后，聚合分子牽拉及堆積而成。從圖3B中可清晰地看出印跡物表面結(jié)構(gòu)較為均一，孔穴狀結(jié)構(gòu)顯著少于MIM。

為了比較MIM與NIM對(duì)模板分子萊克多巴胺的特異性吸附作用，本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選擇已制備好的MIM及NIM各20條（MWCNs 已修飾），將MIM與NIM組合在一起的電極條，與NIM與NIM組合在一起的電極條作對(duì)比（制作方法見(jiàn)2.4）。將其分別置于含有一定濃度（1 mg/L）的萊克多巴胺的溶液中，每個(gè)組合的電極條重復(fù)3次，測(cè)試并記錄相應(yīng)電極條的電導(dǎo)值。結(jié)果表明，MIM與NIM組合在一起的電導(dǎo)值為（1.72±0.052） ms，而NIM與NIM組合在一起的電導(dǎo)值為（0.043±0.003） ms，由此說(shuō)明MIM的特異性吸附能力遠(yuǎn)大于NIM的吸附能力。

圖3 印跡膜 （A）及非印跡膜 （B）的電鏡掃描圖（×20000）

Fig．3 Scanning electron microscopy （SEM） images of MIM （A） and NIM （B） （×20000）

3.2 基于多壁碳納米管和分子印跡膜修飾的電導(dǎo)型傳感器的時(shí)間響應(yīng)曲線

考察了傳感器的響應(yīng)時(shí)間對(duì)靈敏度的影響（見(jiàn)圖4）。為了保證測(cè)試條件的一致性，每個(gè)濃度都減去背景電流值。隨著響應(yīng)時(shí)間和濃度的增加，傳感器的響應(yīng)值也隨之增加。在0 s時(shí)，不同濃度的電導(dǎo)響應(yīng)值在0.8～1.3 ms之間，表明絲網(wǎng)印刷電極的一致性；在30 s后， 電導(dǎo)的響應(yīng)信號(hào)逐漸趨于穩(wěn)定，表明此時(shí)萊克多巴胺分子與洗脫后留下的特殊位點(diǎn)的識(shí)別已趨于飽和。因此，本研究應(yīng)選擇30 s為數(shù)據(jù)采集的最佳時(shí)間。

3.3 多壁碳納米管和分子印跡膜修飾的電導(dǎo)型傳感器的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)曲線

以多壁碳納米管和分子印跡膜為敏感元件的電導(dǎo)傳感方法檢測(cè)萊克多巴胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，回歸方程為y＝0.8577＋0.8663x （r＝0.995），檢出限為0.033 mg/L，在0.33～8.00 mg/L 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。而使用非印跡膜作為感受器， 在相同條件下檢測(cè)萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在不同濃度的溶液下所獲得的電導(dǎo)值無(wú)明顯變化。說(shuō)明洗脫后的MIM存在與萊克多巴胺分子結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的孔穴，溶液中具有電化學(xué)活性的萊克多巴胺分子被特異性吸附至MIM表面后，膜本身的電化學(xué)活性將發(fā)生改變，隨著溶液中萊克多巴胺濃度的變化，而產(chǎn)生相應(yīng)的傳感器響應(yīng)信號(hào)。

3.4 優(yōu)化的測(cè)試條件

考察了pH值對(duì)傳感器響應(yīng)信號(hào)的影響。在強(qiáng)堿的條件下，萊克多巴胺的溶解度非常低；在強(qiáng)酸性條件下，其產(chǎn)生的傳感信號(hào)不穩(wěn)定。因此本實(shí)驗(yàn)在pH 4.0～9.0條件下，對(duì)10 mg/L萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明： 在弱酸性條件下，傳感器的響應(yīng)信號(hào)逐漸增大，在pH 7.0時(shí)，響應(yīng)信號(hào)達(dá)到最大值7.65 ms。在堿性條件下，傳感器的響應(yīng)信號(hào)迅速下降，在pH 9.0時(shí)，響應(yīng)信號(hào)僅為3.45 ms。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)萊克多巴胺的最佳pH值為7.0。

圖4 基于MIM的電導(dǎo)傳感方法檢測(cè)不同濃度萊克多巴胺的時(shí)間響應(yīng)曲線

Fig．4 Sensor response versus time in detection of ractopamine with different concentrations

a. 0.33 mg/L; b 0.50 mg/L; c. 0.83 mg/L; d.1.67 mg/L; e. 3.33 mg/L; f. 5.00 mg/L; g. 8.00 mg/L.

圖5 基于多壁碳納米管和分子印跡膜修飾的絲網(wǎng)印刷電極檢測(cè)萊克多巴胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig．5 Standard curve for determination of ractopamine on conductometric sensor based on MWCNsMIM modified SPE

圖6 不同緩沖液對(duì)電導(dǎo)型傳感器性能的影響?yīng)?/p>

Fig．6 Effect of different buffers on response of conductometric sensor

a. TrisHCl緩沖液（TrisHCl buffer）； b. （HClO4 solution）； c. PBS緩沖液（PBS buffer）；d. BR緩沖液（BR buffer）；e. 碳酸鹽緩沖液 （Na2CO3NaHCO3buffer）；f. 醋酸鹽緩沖液（NaAcHAc buffer）。

分別以10 mg/L萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和pH 7.0～0.2 mol/L TrisHCl緩沖液、BR緩沖液、碳酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、高氯酸和醋酸鹽緩沖液為支持液，采用該傳感體系進(jìn)行檢測(cè)。如圖6所示，以TrisHCl為緩沖液時(shí)，檢測(cè)值最高，其次為HClO4溶液; 以醋酸鹽緩沖液為支持液時(shí)，檢測(cè)值最低。因此，本實(shí)驗(yàn)選用0.2 mol/L TrisHCl緩沖液（pH 7.0）作為支持液。

考察了離子強(qiáng)度對(duì)傳感器測(cè)試萊克多巴胺的影響。結(jié)果表明， 2 mol/L NaCl， KCl等強(qiáng)電解質(zhì)對(duì)電導(dǎo)測(cè)試結(jié)果有顯著影響，可使電導(dǎo)值增加1.52～2.65 ms，因而建議在樣品前處理過(guò)程中通過(guò)液液萃取等方法將高濃度的離子除去。

3.5 干擾實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)選用實(shí)際樣品中可能含有的違禁獸藥鹽酸克倫特羅與沙丁胺醇作為干擾物質(zhì)，將萊克多巴胺和每種干擾物質(zhì)分別以0.2 mol/L TrisHCl緩沖液配制成干擾測(cè)試液，結(jié)果見(jiàn)表1。在0.5 mol/L萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)液和1 mol/L CLB標(biāo)準(zhǔn)液中，測(cè)得的萊克多巴胺的濃度差異不顯著。但加入1 mol/L SAL標(biāo)準(zhǔn)液，所檢測(cè)出的萊克多巴胺濃度顯著降低。此外，當(dāng)上述3種溶液混合后，通過(guò)電導(dǎo)儀檢測(cè)出萊克多巴胺的濃度略有增加。這有可能是干擾物質(zhì)的一些化學(xué)基團(tuán)也能夠被洗脫后的萊克多巴胺分子印跡空穴所識(shí)別，影響了萊克多巴胺分子結(jié)合印跡物的表面^[21]。也有學(xué)者認(rèn)為是在檢測(cè)的過(guò)程中MIM對(duì)各特征基團(tuán)和分子整體進(jìn)行識(shí)別，萊克多巴胺的分子結(jié)構(gòu)與鹽酸克倫特羅差異明顯，不能穩(wěn)定結(jié)合在印跡孔穴中，大部分以布朗運(yùn)動(dòng)的形式在印跡孔穴中出入

檢測(cè)，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）小于2.7%（n＝5）； 隨機(jī)抽取5批次制作的帶有MIM的電極條，檢測(cè)同一濃度的萊克多巴胺樣品，其RSD＜3.5%。將制備好的帶有MIM的電極條在－4 ℃冰箱保存3個(gè)月后，檢測(cè)同一濃度的萊克多巴胺樣品，與剛制備好的電極條檢測(cè)結(jié)果相比，其RSD＜4.8%。6個(gè)月后進(jìn)行檢測(cè)，與初次檢測(cè)相比，其RSD＜6.4%。因此該傳感儀的敏感元件的使用壽命多于6個(gè)月，通過(guò)更換帶有MIM的一次性絲網(wǎng)印刷電極條，該傳感儀可長(zhǎng)期使用^[21]。因此，本實(shí)驗(yàn)制備的基于MIM為感受器的電導(dǎo)型傳感儀具有檢測(cè)速度快、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)， 適用于大批量實(shí)際樣品檢測(cè)。

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

A Conductometric Sensor Based on Screen Printed Electrode Modified

with Multiwalled Carbon Nanotubes and Molecularly Imprinted

Membrane for Determination of Ractopamine in Pig Urine

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ZHANG HongCai， LIU GuoYan， SHANG Jing， WENG ZhiYing， CHAI ChunYan*

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（School of Agricultrue ＆ Biology， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200240）



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Abstract First， multiwall carbon nanotubes（MWCNs） were modified on the screen printed electrode（SPE）， and then molecularly imprinted membrane（MIM） and nonimprinted membrane（NIM） were directly synthesized on the modified SPE by using the insitu thermal polymerization techniques， respectively. A conductometric sensor for the detection of ractopamine was assembled by connecting the SPE modified with MWCNsMIM and the other one coated with MWCNsNIM to a conductometer through an electrode slot. Standard calibration curve was established and the determination of ractopamine in pig urine samples also was performed based on this sensor. Superficial characteristic of MIM and NIM was investigated using scanning electron microscope （SEM）. The results showed that there were number of imprinted micropores on the surface of MIM. The sensor showed high selectivity and specificity towards the target ractopamine. The response of the sensor to concentration of ractopamine displayed a linear correlation over a range from 0.33 to 8.0 mg/L with a detection limit of 0.033 mg/L. The recoveries were 91%－98% based on pig urine samples for the determination of ractopamine on sites.

Keywords Multiwalled carbon nanotubes; Ractopamine; Molecularly imprinted membrane; Conductometric sensor

（Received 18 April 2011; accepted 6 September 2011）