納米纖維固相萃取柱萃取-高效液相熒光法分析頭發(fā)皮質(zhì)醇

摘 要 采用基于納米纖維固相萃取的高效液相色譜熒光測(cè)定 （HPLCFlu） 法測(cè)定頭發(fā)中的皮質(zhì)醇水平。以新型納米纖維萃取柱（PFSPE）提取頭發(fā)樣本浸出液，用100 L甲醇直接洗脫后注入色譜體系進(jìn)行分析。此方法的檢出限為0.05 ng/g（S/N＝3），日內(nèi)精密度和日間精密度分別低于6.8%和8.9%，平均方法回收率為88.9%。本方法提取過程簡(jiǎn)便、快速、環(huán)保，而且可以準(zhǔn)確測(cè)定頭發(fā)樣本中的皮質(zhì)醇水平。

關(guān)鍵詞 納米纖維；頭發(fā)； 皮質(zhì)醇；皮質(zhì)酮；高效液相色譜； 熒光檢測(cè)

1 引 言

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在精神生物學(xué)研究中，皮質(zhì)醇（嚙齒類動(dòng)物是皮質(zhì)酮）是一種非常重要的激素，它被稱為“壓力荷爾蒙”，人體面臨生理、心理刺激時(shí)，其分泌量增高（應(yīng)激反應(yīng)）^[1]。目前研究中采用的血液、唾液、尿液等樣本測(cè)試皮質(zhì)醇的水平，只能反映應(yīng)激及時(shí)變化或一定時(shí)間內(nèi)的累積情況。而對(duì)于研究對(duì)象一段時(shí)間（數(shù)月以上）的應(yīng)激情況進(jìn)行了解，就可以采用頭發(fā)這種生物樣本。研究證實(shí)，頭發(fā)能夠反映人體長(zhǎng)期的攝藥信息（可以追溯到幾個(gè)月之前），頭發(fā)皮質(zhì)醇是一種很好的研究長(zhǎng)期下丘腦垂體腎上腺軸（HPA軸）活性的工具，可以客觀測(cè)量慢性應(yīng)激^[2]。Pereg等^[3]指出，在諸多心梗發(fā)病征兆中，頭發(fā)的皮質(zhì)醇水平是判斷發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)最明顯的生物學(xué)標(biāo)志物。采用頭發(fā)基質(zhì)，對(duì)于分析測(cè)試具有很多優(yōu)勢(shì)，如頭發(fā)生長(zhǎng)規(guī)律，為研究者提供一種追溯性研究窗口；頭發(fā)采樣無創(chuàng)、簡(jiǎn)便、無需專業(yè)指導(dǎo)；頭發(fā)樣本可以室溫儲(chǔ)存等^[2]。頭發(fā)皮質(zhì)醇分析將成為生理學(xué)、精神醫(yī)學(xué)、體育醫(yī)學(xué)、認(rèn)知科學(xué)、心理學(xué)等眾多學(xué)科的重要研究手段。 

目前，頭發(fā)中皮質(zhì)醇測(cè)定多采用放射免疫法^[4]、酶聯(lián)免疫法^[5]及LCMS法^[6]。免疫法靈敏度較高，能夠檢測(cè)出頭發(fā)中的痕量皮質(zhì)醇，但存在交叉反應(yīng)、測(cè)定結(jié)果偏高。各種商業(yè)性的免疫試劑盒測(cè)定的結(jié)果差異性較高，試劑盒的成本也較昂貴。LCMS法雖然準(zhǔn)確靈敏，但需要昂貴的儀器，故一般實(shí)驗(yàn)室難以普及。此外，還有HPLCFlu法測(cè)定頭發(fā)中皮質(zhì)醇分布的報(bào)道^[7]，采用傳統(tǒng)SPE和溶劑萃取的方法分別提取頭發(fā)浸出液和硫酸衍生產(chǎn)物。本研究?jī)?yōu)化改進(jìn)了頭發(fā)樣本前處理操作，用本研究組建立的基于電紡納米纖維的固相萃取技術(shù)（Packedfiber solidphase extraction， PFSPE）^[8，9] 取代文獻(xiàn)方法SPE和溶劑萃取步驟，省略了揮發(fā)提取溶劑濃縮目標(biāo)物的操作，使熱不穩(wěn)定的目標(biāo)物提取效率大大提高，同時(shí)使前處理操作時(shí)間大大縮短、操作更為簡(jiǎn)便，實(shí)現(xiàn)了頭發(fā)中皮質(zhì)醇的高效靈敏檢測(cè)。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

LC20AD高效液相色譜儀、RF10AXL熒光檢測(cè)器、SIL20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO20A柱溫箱均購(gòu)自日本島津公司；DDSPH計(jì)（上海理達(dá)儀器廠）、離心機(jī)（無錫瑞江公司）；XW80A漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）； AL104IC分析天平（METTLER TOLEDO）； MM 400冷凍混合型球磨儀（德國(guó)萊馳公司）；HY2調(diào)速多用振蕩器（常州國(guó)華電器有限公司）；XWy01型納米纖維固相萃取柱（蘇州先偉納米技術(shù)有限公司）。

皮質(zhì)醇（又名氫化可的松）和皮質(zhì)酮標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇（色譜純， 山東禹王化學(xué)品公司），H2SO4、乙醇等其它試劑分析純。實(shí)驗(yàn)用水為重蒸去離子水。