化學(xué)發(fā)光免疫分析方法與應(yīng)用進(jìn)展

摘 要 化學(xué)發(fā)光免疫分析方法具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、設(shè)備簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，在環(huán)境、臨床、食品、藥物檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。在實(shí)際應(yīng)用中，常常需要對(duì)大量復(fù)雜樣品或低豐度分析物樣品進(jìn)行測(cè)定。而經(jīng)典商品化的免疫分析方法所需時(shí)間長(zhǎng)、樣品消耗多、成本高，不能滿(mǎn)足上述要求。因而建立快速、高通量、高靈敏和低成本的免疫檢測(cè)方法已成為化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的研究熱點(diǎn)和發(fā)展趨勢(shì)。本文簡(jiǎn)要總結(jié)近5年來(lái)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的研究進(jìn)展及其應(yīng)用，并展望其發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞 化學(xué)發(fā)光免疫分析； 免疫傳感； 快速檢測(cè)； 多通道檢測(cè)； 評(píng)述

1 引 言

近年來(lái)，化學(xué)發(fā)光免疫分析方法由于其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、適用面廣、所需設(shè)備簡(jiǎn)單、線(xiàn)性范圍較寬等優(yōu)點(diǎn)，日益受到人們的青睞^[1～5]，在生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)以及環(huán)境、食品、藥物等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用^[6，7]。免疫分析過(guò)程所涉及的免疫反應(yīng)主要是抗原與抗體間的識(shí)別。這些生物分子的體積大、擴(kuò)散速率小，且由于對(duì)識(shí)別位點(diǎn)的空間阻礙作用，受傳質(zhì)速率和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)控制的免疫反應(yīng)速率一般比較低。因而傳統(tǒng)的免疫分析方法需要較長(zhǎng)的溫育時(shí)間，常常需要數(shù)小時(shí)才能完成整個(gè)分析過(guò)程，大大限制了樣品通量和應(yīng)用范圍。為縮短免疫分析的時(shí)間，研究工作者已設(shè)計(jì)了不同的方法，通過(guò)提高傳質(zhì)速率和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)來(lái)實(shí)現(xiàn)快速免疫檢測(cè)，從而擴(kuò)展化學(xué)發(fā)光免疫分析的應(yīng)用范圍。

在實(shí)際應(yīng)用中，經(jīng)常涉及到復(fù)雜體系多組分的測(cè)定。如在臨床腫瘤診斷中，由于腫瘤標(biāo)志物的特異性不足，常選擇幾種腫瘤標(biāo)志物組成標(biāo)志物組，通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)提高臨床診斷的特異性^[8，9]；又如在環(huán)境監(jiān)控中，經(jīng)常需要同時(shí)監(jiān)測(cè)天然水體中多種殺蟲(chóng)劑與除草劑的濃度指標(biāo)，以綜合評(píng)價(jià)環(huán)境污染狀況^{[10，11]}。測(cè)定混合體系中多組分的含量通常只能采用多次單組分分析法，這種方法所需時(shí)間長(zhǎng)、試劑消耗多、工作量過(guò)大。多組分同時(shí)或順序檢測(cè)具有分析通量高、所需時(shí)間短、樣品消耗少、分析成本低等突出優(yōu)點(diǎn)，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。已報(bào)道的新型化學(xué)發(fā)光多組分免疫分析方法中，有的通過(guò)設(shè)計(jì)芯片^[12～17]，結(jié)合流動(dòng)注射、電感耦合元件（CCD）技術(shù)達(dá)到多組分測(cè)定；有的利用固相載體的特性，通過(guò)溫度分辨模式^[18]，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)的目的。

另一方面，在實(shí)際應(yīng)用中，常常需要檢測(cè)低豐度分析物樣品，發(fā)展高靈敏的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，是近年來(lái)免疫分析方法發(fā)展的主要方向。降低噪音和增強(qiáng)信號(hào)是提高免疫分析靈敏性的主要途徑。降低噪音主要用小蛋白對(duì)生物功能界面進(jìn)行封閉，以防止干擾物的非特異性吸附。免疫分析信號(hào)增強(qiáng)技術(shù)主要集中在功能界面的構(gòu)建與信號(hào)探針?lè)糯髢蓚€(gè)方面。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料，如金納米粒子、碳納米管、碳納米角、SiO2納米粒子、量子點(diǎn)以及它們的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，已用于超靈敏免疫傳感器的構(gòu)建，納米粒子在生物標(biāo)記分析中的廣泛應(yīng)用取得了突破性的進(jìn)展^[19，20]。一些納米粒子不僅可以作為模擬酶直接催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)^[21～24]，還可以用來(lái)負(fù)載大量的酶，通過(guò)酶催化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大^[25～31]，使納米技術(shù)在高靈敏化學(xué)發(fā)光免疫分析中得到廣泛應(yīng)用，也促進(jìn)了化學(xué)發(fā)光免疫分析的快速發(fā)展。

本文簡(jiǎn)要介紹了化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的原理，總結(jié)了近幾年來(lái)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的研究進(jìn)展，并就化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的前景進(jìn)行了展望。

2 化學(xué)發(fā)光免疫分析法

化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光的強(qiáng)度來(lái)確定物質(zhì)含量的分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用化學(xué)發(fā)光相關(guān)的物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，與待測(cè)的抗原或抗體反應(yīng)后，經(jīng)過(guò)分離游離態(tài)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，加入化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的其它相關(guān)物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，進(jìn)行抗原或抗體的定量或定性檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析中使用最多的4類(lèi)標(biāo)記物為魯米諾、異魯米諾及其衍生物，吖啶酯衍生物，過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶。

以酶為標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光仍然是化學(xué)發(fā)光免疫分析的主流，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）與堿性磷酸酶（ALP）是兩種常見(jiàn)的標(biāo)記酶，均有其相應(yīng)的化學(xué)發(fā)光底物，在臨床檢驗(yàn)中有廣泛應(yīng)用，開(kāi)發(fā)催化活性更高、穩(wěn)定性更好、發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)更符合免疫分析的酶和底物是化學(xué)發(fā)光免疫分析的研究熱點(diǎn)之一。

標(biāo)記技術(shù)是現(xiàn)代免疫分析的關(guān)鍵技術(shù)之一。新的標(biāo)記免疫分析技術(shù)，在環(huán)境監(jiān)測(cè)^[32，33]、臨床診斷^[34，35]、食品安全^[36，37]、藥物分析^[38，39]與微生物檢驗(yàn)^[40，41]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，展示了良好的應(yīng)用前景。由于納米粒子具有良好的生物相容性和信號(hào)放大效果，納米技術(shù)廣泛用于生物標(biāo)記，例如，金納米粒子（AuNPs）可以用于標(biāo)記抗體，增強(qiáng)魯米諾過(guò)氧化氫體系的化學(xué)發(fā)光^[23，24]。量子點(diǎn)是一種能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米顆粒，不易失活、受外部環(huán)境影響小、性質(zhì)穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，且比化學(xué)發(fā)光免疫分析法常用標(biāo)記酶具備更好的光學(xué)特性，成本也相對(duì)較低。Huang等^[42]用化學(xué)發(fā)光作為能量供體，激發(fā)量子點(diǎn)發(fā)光，實(shí)現(xiàn)了基于化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)移的靈敏檢測(cè)。

化學(xué)發(fā)光免疫分析方法既具有化學(xué)發(fā)光分析的高靈敏性，又具有免疫反應(yīng)的高度特異性。在臨床診斷、食品安全及環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用和發(fā)展前景^[43～45]。

3 化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的應(yīng)用

3.1 快速化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

傳統(tǒng)的免疫分析方法常常需要數(shù)小時(shí)才能完成，長(zhǎng)的溫育時(shí)間還導(dǎo)致免疫試劑在管道內(nèi)壁的吸附，增加了不同測(cè)定之間的信號(hào)交叉，因而限制了樣品的檢測(cè)通量和免疫分析方法的應(yīng)用價(jià)值。為了克服這些不足并實(shí)現(xiàn)免疫分析的高通量，可通過(guò)外場(chǎng)驅(qū)動(dòng)或?qū)θ芤哼M(jìn)行有效混合策略加快抗原、抗體等生物大分子的傳質(zhì)速率，或提高反應(yīng)體系的溫度來(lái)加速免疫反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，從而實(shí)現(xiàn)快速免疫檢測(cè)。

提高傳質(zhì)速率的方法有電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)^[46]、電磁攪拌^[47]、改變電滲流^[48]、超聲波驅(qū)動(dòng)^[49] 等方法。2007年， Morozov等^[50]結(jié)合電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)和磁場(chǎng)富集的方法，構(gòu)建了一個(gè)微流控器件，在流通池內(nèi)施加一定的電壓，使帶有電荷的待測(cè)物向微陣列表面移動(dòng)， 圖1 微氣泡加速化學(xué)發(fā)光免疫分析方法^[51]

Fig．1 Microbubble accelerated immunoreaction for fast flowinjection immunoassay^[51]同時(shí)在溫育過(guò)程中用磁鐵將標(biāo)記有磁珠的分子探針富集在微陣列的表面。這種雙重加速的方法使整個(gè)分析過(guò)程在3 min內(nèi)完成。

外力驅(qū)動(dòng)的加速方式都需要附加設(shè)備，Yang等^[51]在免疫反應(yīng)過(guò)程中，勻速通入氮?dú)庑纬晌馀?，可使溫育時(shí)間縮短一半（圖1）。

這種微氣泡加速免疫反應(yīng)的方法簡(jiǎn)單靈活，成本低廉，可使整個(gè)分析流程，包括預(yù)溫育和免疫傳感器的再生， 16 min即可完成。

利用通道的幾何形狀促使流體混合，同樣可以加速免疫分析^[52]。當(dāng)流體經(jīng)過(guò)一個(gè)弧形的管道，由于離心力的作用，會(huì)產(chǎn)生截面上的橫向二次流動(dòng)，從而產(chǎn)生混合作用。Liu等^[53]設(shè)計(jì)了一種三維螺旋玻璃管用于溫育過(guò)程，溫育液在管內(nèi)流動(dòng)產(chǎn)生湍流現(xiàn)象，加速了免疫試劑的混合，從而加速免疫反應(yīng)。提高免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是加速免疫分析的另一重要因素。紅外輻射可以快速加熱和控制溫度^[54，55]。結(jié)合了三維螺旋玻璃管和可控紅外加熱石英管的溫育系統(tǒng)（圖2），通過(guò)雙重加速免疫反應(yīng)，可使免疫反應(yīng)在90 s內(nèi)完成，所有的分析步驟在3 min內(nèi)完成。

圖2 螺旋管混合、紅外加熱的雙重加速化學(xué)發(fā)光免疫分析方法^[53]

Fig．2 Dually accelerated immunoreaction by infrared heating and passive mixing^[53]

3.2 多組分化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

在單個(gè)分析流程中同時(shí)實(shí)現(xiàn)多組分的檢測(cè)，具有分析通量高、所需時(shí)間短、樣品消耗少、分析成本低等突出優(yōu)點(diǎn)^[56]，是免疫分析長(zhǎng)期追求的目標(biāo)，也是近年來(lái)免疫分析的研究熱點(diǎn)。多組分免疫分析模式主要有多組分同時(shí)檢測(cè)模式和順序檢測(cè)模式兩種同時(shí)檢測(cè)模式常結(jié)合空間分辨技術(shù)與陣列檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)待測(cè)物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，順序檢測(cè)則是在一段時(shí)間內(nèi)對(duì)多個(gè)組分逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè)。近年來(lái)，基于電極陣列和多通道電化學(xué)工作站的安培免疫傳感器陣列在多組分免疫分析領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。而隨著順序注射多組分分析中主要問(wèn)題的解決，多組分化學(xué)發(fā)光免疫分析方法得到了快速發(fā)展。

Fu等^[14]提出了底物區(qū)帶分辨化學(xué)發(fā)光多組分免疫傳感系統(tǒng)，在單個(gè)分析流程中檢測(cè)兩種腫瘤標(biāo)志物：癌胚抗原125（CA125）和癌胚抗原（CEA）。將兩種腫瘤標(biāo)志物的捕獲抗體同時(shí)固定于醛基活化的UltraBindTM膜上，構(gòu)成免疫反應(yīng)器，然后將樣品、HRP標(biāo)記的CA125抗體與ALP標(biāo)記的CEA抗體注入免疫反應(yīng)器進(jìn)行在線(xiàn)溫育，在夾心免疫反應(yīng)后依次通入HRP與ALP的化學(xué)發(fā)光底物區(qū)帶，實(shí)現(xiàn)兩種腫瘤標(biāo)志物的類(lèi)同時(shí)檢測(cè)。該研究組還提出了通道分辨的概念^[15]，發(fā)展了一套自動(dòng)化的流通式化學(xué)發(fā)光多組分免疫傳感系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用移動(dòng)光門(mén)分別檢測(cè)3個(gè)通道中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)3種腫瘤標(biāo)志物的類(lèi)同時(shí)檢測(cè)。隨后他們進(jìn)一步結(jié)合通道分 圖3 通道底物二維分辨的化學(xué)發(fā)光多組分免疫分析方法^[16]

Fig．3 Channel and substrate zone twodimensional resolution for multiplex immunoassay of tumor markers^[16]辨和底物分辨技術(shù)，提出了二維分辨新概念^[16]，設(shè)計(jì)了雙通道流通池，用于化學(xué)發(fā)光多組分免疫分析，可同時(shí)檢測(cè)4種腫瘤標(biāo)志物（圖3）。該研究組為了克服檢測(cè)組分?jǐn)?shù)不足的缺點(diǎn)，進(jìn)一步設(shè)計(jì)了進(jìn)樣分辨^[57]和支持物分辨技術(shù)^[58]。進(jìn)樣分辨化學(xué)發(fā)光多組分免疫分析基于異相夾心免疫分析，以環(huán)氧基修飾的磁性微珠作為固定捕獲抗體的載體。它將固定了4種捕獲抗體的磁珠，對(duì)應(yīng)的4種ALP標(biāo)記的抗體和4份待測(cè)樣品分別裝入4個(gè)裝有微型磁攪拌子的小試管中，在水浴以及磁力攪拌的條件下進(jìn)行同時(shí)溫育后由4個(gè)玻璃管道同時(shí)進(jìn)樣，并進(jìn)行磁性分離和順序洗滌，再將ALP化學(xué)發(fā)光底物通入4個(gè)管道與磁珠混合，并依次將形成的4個(gè)通道內(nèi)的混合物通過(guò)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)支持物分辨技術(shù)也稱(chēng)為載體分辨技術(shù)，它將捕獲抗體分別固定在不同的玻璃管內(nèi)壁，將這些玻璃管串聯(lián)后通入溫育混合物，進(jìn)行在線(xiàn)溫育通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的沖洗步驟，

在不同的玻璃管內(nèi)形成不同的夾心免疫復(fù)合物，借助移動(dòng)光門(mén)，順序采集化學(xué)發(fā)光信號(hào)可以實(shí)現(xiàn)多組分的順序定量。該傳感系統(tǒng)為臨床應(yīng)用提供了一個(gè)有前景的多組分免疫分析方法。作為免疫固定相，磁性微球具有大的表面積，并且便于抗體抗原復(fù)合物從分離介質(zhì)中分離^[59～62]。Zhang等^[63]將抗體分別固定在磁性納米微球上和涂層管上用于檢測(cè)甲胎蛋白（AFP），比較了這兩種固相載體的分析優(yōu)勢(shì)，并以磁性微球?yàn)楣滔噍d體檢測(cè)了59種人體血清樣本，檢測(cè)結(jié)果與商用方法的結(jié)果一致。

圖4 溫度底物二維分辨的多組分化學(xué)發(fā)光免疫分析方法^[18]

Fig．4 Homogeneous temperature and substrate resolved technologies for CL detection of four proteins^[18]



近年來(lái)，智能水凝膠研究得到發(fā)展，其中熱敏性水凝膠具有隨溫度變化而發(fā)生溶解和溶漲狀態(tài)突變的性質(zhì)。Kang等^[18]根據(jù)這種現(xiàn)象，結(jié)合底物分辨技術(shù)，將4種抗體分成2組，分別固定在熱敏性的聚N異丙基丙烯酰胺（PNIP）和磁珠上，升溫至“臨界析相溫度”（35 ℃）時(shí)PNIP沉淀析出； 通過(guò)磁力分離磁珠后， 分別用同一種固定相的抗體結(jié)合抗原及不同酶標(biāo)記的抗體，形成夾心免疫復(fù)合物； 通入各自對(duì)應(yīng)的化學(xué)發(fā)光底物，可以順序檢測(cè)4種不同的抗體，如圖4所示。這種分辨方式存在一定的問(wèn)題，分析過(guò)程涉及到繁瑣的手動(dòng)操作，給操作的自動(dòng)化帶來(lái)困難，且分析時(shí)間較長(zhǎng)。

Liu等^[64]在96孔板中進(jìn)行免疫反應(yīng)，借助帶有旋轉(zhuǎn)軸的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了操作的自動(dòng)化，避免了手動(dòng)操作的繁瑣。每個(gè)孔的檢測(cè)時(shí)間為1 s，即只需要2 min即可完成96種組分的檢測(cè)。這種順序檢測(cè)方法的各組分是按時(shí)間順序依次檢測(cè)的，如果檢測(cè)大量的組分，就會(huì)產(chǎn)生時(shí)間累加的效應(yīng)，從檢測(cè)第一個(gè)組分到最后一個(gè)組分需要間隔很長(zhǎng)時(shí)間。

空間分辨模式是在免疫反應(yīng)器的不同區(qū)域固定不同組分相應(yīng)的免疫試劑，使不同組分的免疫反應(yīng)在不同的空間位置發(fā)生，然后以陣列檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，以實(shí)現(xiàn)多組分的檢測(cè)。CCD的應(yīng)用使得化學(xué)發(fā)光免疫分析的檢測(cè)更加方便，同時(shí)也促進(jìn)了化學(xué)發(fā)光成像檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析方法結(jié)合CCD圖像傳感器，可以滿(mǎn)足在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)測(cè)量大量樣品的要求。Urbanowska等^[65]用96孔板作為固相載體固定抗體，用化學(xué)發(fā)光成像法同時(shí)檢測(cè)6種蛋白質(zhì)。Magliulo等^[66]設(shè)計(jì)了一種新型的聚苯乙烯96孔微量滴定板，將每個(gè)大孔內(nèi)又分隔成4個(gè)小孔。每種細(xì)菌的單克隆抗體分別固定于小孔中，待測(cè)樣品加入大孔內(nèi)，特定細(xì)菌會(huì)與特定抗體特異性結(jié)合，然后向大孔內(nèi)加入各自的酶標(biāo)抗體，加入發(fā)光底物，用CCD積分拍攝，可以同時(shí)檢測(cè)96×4種樣品，如圖5所示。

將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析，可以拓展免疫分析的應(yīng)用領(lǐng)域。在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)陣列式的分析和檢測(cè)，可以大幅度提高芯片的檢測(cè)容量，對(duì)多種樣品進(jìn)行同時(shí)分析，非常適合疾病診斷、藥物篩選等方面的應(yīng)用。Sun等^[12]設(shè)計(jì)了一個(gè)三維芯片，可以用化學(xué)發(fā)光圖像分析方法同時(shí)檢測(cè)96種組分的樣品。Wolter等^[13]克服了傳統(tǒng)CCD靜態(tài)檢測(cè)方法的耗時(shí)及不利于自動(dòng)化等缺點(diǎn)，發(fā)展了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光陣列體系。他們將捕獲抗體固定在聚乙二醇修飾的芯片上，設(shè)計(jì)了6×7的陣列，再用生物素化的抗體識(shí)別細(xì)菌，最后利用親和素化的HRP與信號(hào)抗體結(jié)合，催化魯米諾和H2O2的反應(yīng)，得到化學(xué)發(fā)光信號(hào)。進(jìn)樣以及沖洗過(guò)程都采用流動(dòng)注射技術(shù)，控制不同的閥，實(shí)現(xiàn)了整個(gè)分析過(guò)程的自動(dòng)化。測(cè)定所有不同濃度、不同種類(lèi)的細(xì)菌在13 min內(nèi)完成，如圖6所示。 圖5 基于新型96孔板的化學(xué)發(fā)光成像免疫分析方法用于多組分檢測(cè)^[66]

Fig．5 New 96×4 well microtiter plate for multiplexed chemiluminescent imaging immunoassay^[66]

圖6 微流控芯片的化學(xué)發(fā)光成像免疫分析方法用于三種細(xì)菌的檢測(cè)^[13]

Fig．6 A flowthrough chemiluminescence microarray readout system for the detection of three bacteria^[13]

3.3 高靈敏化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

在實(shí)際檢測(cè)中，現(xiàn)有的檢測(cè)手段靈敏度和特異性不夠理想，高靈敏高選擇性的檢測(cè)方法越來(lái)越顯示出其重要性。納米技術(shù)的發(fā)展為高靈敏化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的發(fā)展提供了契機(jī)，納米粒子在生物標(biāo)記分析得到了廣泛應(yīng)用，已有多種信號(hào)放大方法用于高靈敏免疫分析方法的構(gòu)建。

Zhang等^[23]發(fā)現(xiàn)不同粒徑的AuNPs可以增強(qiáng)魯米諾過(guò)氧化氫體系的化學(xué)發(fā)光，其中38 nm粒徑的AuNPs增強(qiáng)效果最明顯。Wang等^[24]合成了特殊形狀的不規(guī)則金納米粒子（IGNPs），并且發(fā)現(xiàn)IGNPs對(duì)魯米諾過(guò)氧化氫化學(xué)發(fā)光體系的催化活性是球狀A(yù)uNPs的100倍，同時(shí)他們將抗體固定在IGNPs表面，形成夾心免疫復(fù)合物。由于IGNPs的催化活性，在無(wú)酶的情況下，加入化學(xué)發(fā)光底物即可得到化學(xué)發(fā)光信號(hào)。 圖7 基于酶標(biāo)抗體功能化的AuNPs信號(hào)放大的超靈敏化學(xué)發(fā)光免疫分析方法^[26]

Fig．7 Ultrasensitive enhanced chemiluminescence enzyme immunoassay amplified by doublecodified gold nanoparticles labels^[26]

Ambrosi等^[67]提出了雙編碼的AuNPs用于放大免疫分析信號(hào)，即在AuNPs表面連接大量HRP標(biāo)記的抗體。由于HRP具有催化活性，因而能顯著增強(qiáng)信號(hào)。Yang等^[26]將這種雙編碼的標(biāo)記物用于放大化學(xué)發(fā)光信號(hào)，同時(shí)在發(fā)光體系中加入增強(qiáng)劑對(duì)碘苯酚，進(jìn)一步增強(qiáng)信號(hào)。以AFP為檢測(cè)模型，線(xiàn)性范圍為0.008～0.3 g/L，檢出限為5 ng/L，如圖7所示。

AuNPs的粒徑較小，不能負(fù)載足夠多的酶，因而研究者嘗試用更多的納米材料負(fù)載大量的酶。Bi等^[29]采用了多層酶包裹的納米碳管作為標(biāo)記物放大化學(xué)發(fā)光檢測(cè)信號(hào)。先將多壁碳納米管用酸處理使其表面帶有羧基，用層層組裝方法將多層鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯（PDDA）與HRP吸附在碳納米管表面，標(biāo)記抗體后進(jìn)行免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物。這種層層吸附的方法使得標(biāo)記物連接了大量的酶，線(xiàn)性范圍為0.02～2.0 g/L，檢出限為8.0 ng/L，比傳統(tǒng)方法低2個(gè)數(shù)量級(jí)。

由于酶標(biāo)抗體的位阻較大，研究者將酶直接連接到納米材料表面，再以一定的比例固定抗體，既能連接大量酶，又減小位阻。Wu等^[30]用HRP直接標(biāo)記硅納米粒子，發(fā)展了新型高靈敏的免疫檢測(cè)方法。首先用晶種生長(zhǎng)的方法合成SiO2納米粒子，粒徑為（103±7） nm， 圖8 功能化三維有序SiO2納米多孔膜為載體的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法^[68]

Fig．8 Threedimensional ordered nanoporous silica film for highly efficient chemiluminescent immunosensin^[68]然后用環(huán)氧丙基醚丙基三甲氧基硅烷作為交聯(lián)劑處理硅納米粒子，從而分別連接HRP和AFP抗體。采用兩步夾心免疫法，第一步免疫反應(yīng)結(jié)束后，將HRP功能化的硅納米粒子信標(biāo)注入流通池，保證免疫反應(yīng)導(dǎo)入酶量的最大化，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)增大。硅納米粒子還能降低物理吸附， 進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。檢測(cè)線(xiàn)性范圍為0.01～3.0g/L。與傳統(tǒng)夾心免疫方法相比，該方法信號(hào)增強(qiáng)了61倍，具備高靈敏度和可重復(fù)性。該方法簡(jiǎn)單方便、低耗、特異性好，可以推廣到臨床運(yùn)用。利用三維有序SiO2納米多孔膜的高負(fù)載量。Yang等^[68]提出了一種新的高靈敏化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。該多孔的SiO2膜以聚苯乙烯球（PS）為模板，通過(guò)在玻璃片表面自組裝沉積5 nm SiO2納米粒子，然后煅燒除去模板制得。以γ縮水甘油醚丙基三甲氧基硅（GPTMS）為交聯(lián)劑，可將SiO2納米多孔膜進(jìn)行鏈霉親和素的功能化，與生物素標(biāo)記抗體結(jié)合，制得的化學(xué)發(fā)光免疫傳感器（圖8）。多孔膜可以促進(jìn)免疫試劑的傳質(zhì)，因而制得的化學(xué)發(fā)光免疫傳感器具有寬的檢測(cè)線(xiàn)性范圍、快的分析速度與良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。以糖類(lèi)抗原（CA 125）為模型分析物，其線(xiàn)性范圍為0.5～400 U/mL， 可達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)，而不用三維有序SiO2納米多孔膜為載體的免疫分析方法，在相同條件下的線(xiàn)性范圍僅為5～40 U/mL。

天然酶在保存過(guò)程中結(jié)構(gòu)的變化很容易喪失催化活性，純化天然酶的昂貴代價(jià)也制約了它們的應(yīng)用，而且天然酶的催化活性也會(huì)因?yàn)榇蠓肿与陌窕钚晕稽c(diǎn)而被制約。研究者努力制備人工模擬酶用于信號(hào)放大，新型的信號(hào)增強(qiáng)技術(shù)， 如DNA酶放大技術(shù)^[69]、滾環(huán)擴(kuò)增法^[70]以及雜交連鎖反應(yīng)^[71]等不斷涌現(xiàn)，但目前還沒(méi)有運(yùn)用到化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)中，這也為新型化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法提供了機(jī)遇。

4 發(fā)展與展望

化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在環(huán)境、臨床、食品、藥物檢測(cè)中得到了廣泛運(yùn)用。實(shí)際檢測(cè)常常需要對(duì)大量、復(fù)雜、低豐度的樣品進(jìn)行測(cè)定，因而化學(xué)發(fā)光免疫分析法逐漸向快速、高通量、高靈敏檢測(cè)的方向發(fā)展。本文總結(jié)了近幾年化學(xué)發(fā)光免疫分析法的應(yīng)用進(jìn)展，涉及到降低溫育時(shí)間，多組分檢測(cè)，以及信號(hào)放大技術(shù)。這些例子都證明了化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有廣泛的應(yīng)用前景和可操作性。

此外，化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分析與分離技術(shù)的聯(lián)用，可以使免疫分析的選擇性、靈敏度和檢測(cè)速度、檢測(cè)通量得到進(jìn)一步提高。為了更好地適應(yīng)臨床、環(huán)境等領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用，需要大力發(fā)展微型化、集成化和自動(dòng)化的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀器。隨著分子生物學(xué)及納米與傳感技術(shù)的進(jìn)步，新的化學(xué)發(fā)光免疫分析原理與高靈敏的免疫分析方法將得到不斷發(fā)展，開(kāi)發(fā)催化活性更高、穩(wěn)定性更好、發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)更符合免疫分析的酶和底物并推廣到臨床檢測(cè)，發(fā)展新型標(biāo)記技術(shù)用于信號(hào)放大，建立化學(xué)發(fā)光免疫分析新方法，都將是未來(lái)的發(fā)展方向及研究重點(diǎn)。

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Chemiluminescent Immunoassay and Its Application

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WANG Chen， WU Jie， ZONG Chen， XU Jie， JU HuangXian

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（State Key Laboratory of Analytical Chemistry for Life Science， Nanjing University， Nanjing 210093）

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Abstract Chemiluminescent immunoassay （CLIA） has been applied in different fields including environmental， clinical diagnosis， food safety， and pharmaceutical analysis as a promising approach for selective， sensitive， rapid and simple analysis．It is often necessary to detect a large number of complicated or low abundance samples. However， traditional method needs great consumptions of time， reagent and labor， which limit their clinical applications．As a result， building rapid， high throughput， sensitive and low cost detection methods has become the development trend for CLIA．In this review， we summarize the recent advances in CLIA and its application， and point out the future development of CLIA．

Keywords Chemiluminescent immunoassay; Immunosensing; Rapid detection; Multiplexed detection; Review

（Received 2 July 2011; accepted 10 September 2011）