植物次生代謝途徑的遺傳操作

王曉云，夏循禮，黃鳳蘭，張壽文

1 江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 江西省中藥種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330004

2 內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000

綜 述

植物次生代謝途徑的遺傳操作

王曉云1，夏循禮1，黃鳳蘭2，張壽文1

1 江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 江西省中藥種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330004

2 內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000

王曉云, 夏循禮, 黃鳳蘭, 等. 植物次生代謝途徑的遺傳操作. 生物工程學(xué)報, 2012, 28(10): 1151?1163.

Wang XY, Xia XL, Huang FL, et al. Genetic modification of secondary metabolite biosynthesis in higher plants: a review.Chin J Biotech, 2012, 28(10): 1151?1163.

植物次生代謝產(chǎn)物種類極其豐富，是人類的寶貴資源，這些產(chǎn)物及其合成途徑相關(guān)酶具有空間特異性分布的特征。植物次生代謝途徑的調(diào)控是個復(fù)雜的過程，受代謝產(chǎn)物水平、多酶復(fù)合物相互作用等多種因素的影響。通過遺傳操作改造代謝過程，調(diào)控產(chǎn)物在植物體內(nèi)的含量，是一條切實(shí)可行和具有廣闊發(fā)展空間的途徑。目前，改造植物次生代謝途徑可以采取單基因操作和多基因操作兩種策略進(jìn)行。

次生代謝產(chǎn)物，途徑，調(diào)控，單基因操作，多基因操作

Abstract:Plants provide an immense reservoir of natural secondary metabolites. Secondary metabolites and those involved enzymes accumulate in various compartments in specific plant tissues. The biosynthesis of diverse groups of secondary metabolites is often complicated, tightly controlledvianetwork interconnections, metabolite levels, metabolite channeling and multi-enzyme complexes, and so on. Secondary metabolite profiles could be genetically altered by twostrategies, i.e. single gene modification and multiple gene modification; which thus has opened a feasible and prospective platform for secondary chemicals production in plant.

Keywords:secondary metabolite, biosynthesis, regulation, single gene manipulation, multiple gene manipulation

植物次生代謝產(chǎn)物由次生代謝途徑產(chǎn)生，是細(xì)胞生命活動正常運(yùn)行時非必需的小分子有機(jī)化合物，種類繁多。它的分布通常具有種屬、器官、組織和生長發(fā)育時期的特異性，是許多重要天然藥物的主要來源，有些對人類健康有益。植物次生代謝途徑是高度分支的途徑，組成結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，受途徑互作、反饋抑制、前饋激活和酶催化反應(yīng)等各種機(jī)制的調(diào)控，形成相互作用的代謝網(wǎng)絡(luò)。

植物次生代謝產(chǎn)物的合成和分解是動態(tài)的，代謝途徑構(gòu)成的空間網(wǎng)絡(luò)受到非常精準(zhǔn)的調(diào)控。1) 次生代謝產(chǎn)物和催化酶往往定位在特定的細(xì)胞器中。例如，現(xiàn)在認(rèn)為，與倍半萜、三萜、類胡蘿卜素、甾體和輔酶Q等合成相關(guān)的甲羥戊酸(Mevalonate，MVA) 途徑主要在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中進(jìn)行，這一途徑可以合成異戊烯基焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP) 前體；而有些植物體內(nèi)還存在 2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸生物合成途徑 (2-methyl-D-erythritol 4-phosphate pathway，MEP pathway)，也可以產(chǎn)生IPP，該途徑卻是在質(zhì)體中進(jìn)行，它能夠合成IPP的異構(gòu)體焦磷酸二甲基烯丙酯 (Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)，半萜、單萜、二萜和一些多萜就是通過MEP途徑在質(zhì)體中合成的。這兩條途徑并非完全獨(dú)立，它們之間存在著代謝中間產(chǎn)物的交換，IPP在異構(gòu)酶的作用下能夠轉(zhuǎn)變成 DMAPP。紫杉醇可能就是這兩條途徑的共同產(chǎn)物[1]。2) 次生代謝途徑還具有多細(xì)胞區(qū)域化分布現(xiàn)象，即常常分布在特定的細(xì)胞類型內(nèi)。長春花Catharanthus roseus(Linn.) G. Don是抗腫瘤藥物長春堿和長春新堿的生物來源，它含有100多種具有重要藥用價值的單萜吲哚生物堿類化合物，所有這些化合物都是經(jīng)由中間產(chǎn)物 3α(S)-異胡豆苷合成的。色氨酸脫羧酶(Tryptophan decarboxylase，TDC) 和異胡豆苷合酶 (Strictosidine synthase，STR1) 是合成 3α(S)-異胡豆苷的關(guān)鍵酶，這兩個酶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物定位在葉片表皮、根尖頂端分生組織周圍的原表皮層和皮層細(xì)胞中[2-3]。3) 大多數(shù)次生代謝產(chǎn)物都積聚在植物特定器官或特殊的組織結(jié)構(gòu)中，如分布在異形細(xì)胞、乳汁器、腺毛簇、分泌細(xì)胞等部位。例如，特化的腺體結(jié)構(gòu)是單萜類和黃酮類化合物產(chǎn)生的部位。合成長春堿的前體物質(zhì)是長春朵靈 (Vindoline)，具有持久的降血糖作用，脫乙酰氧基文朵靈-4-羥化酶 (Desacetoxyvindoline 4-hydroxlyase，D4H) 和脫乙酰文朵靈4-O-乙?；D(zhuǎn)移酶 (Deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase，DAT) 是長春朵靈生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，這兩個酶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物定位在發(fā)育葉片的乳汁器和異形細(xì)胞內(nèi)[2-3]。

多數(shù)次生代謝產(chǎn)物在植物中的含量低于干重的 1%[4]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足需要。人們采取多種策略提高它們的含量。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)是提高次生代謝產(chǎn)物含量的主要手段之一，采用該手段時常常需要進(jìn)行前體飼喂，并篩選高產(chǎn)細(xì)胞系。需要特別注意的是，由于植物次生代謝途徑各步驟的催化酶和代謝物特異地分布在特定器官、組織、細(xì)胞類型和細(xì)胞器內(nèi)，進(jìn)行細(xì)胞或組織培養(yǎng)時必須采用特定的細(xì)胞類型為材料，否則無法獲得高產(chǎn)量的目的代謝產(chǎn)物，在培養(yǎng)物中也難以檢測到合成途徑的關(guān)鍵酶[5]。

對植物次生代謝途徑進(jìn)行遺傳操作，是提高次生代謝產(chǎn)物含量最有效的一個手段，具有廣闊的發(fā)展空間。遺傳操作建立在對植物次生代謝途徑有一定了解的基礎(chǔ)之上，相關(guān)知識包括整個途徑的組成步驟；催化各步反應(yīng)的酶及其編碼基因；調(diào)控因子及其編碼基因；酶、調(diào)控因子、中間代謝物和終產(chǎn)物的組織定位和細(xì)胞器定位；終產(chǎn)物和中間代謝物的流向；途徑中的能量流等。植物細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立，顯著提高了培養(yǎng)物中的酶含量，極大地改善了酶的檢測和純化手段。這些手段反過來被應(yīng)用于原植物，鑒定了大量代謝途徑相關(guān)酶。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動著人們克隆了大量次生代謝途徑的相關(guān)基因，使得從基因水平對代謝途徑進(jìn)行遺傳操作成為可能。

目前，對植物次生代謝途徑進(jìn)行遺傳操作，提高代謝產(chǎn)物含量時，通常采取以下策略。

1 針對單個基因進(jìn)行遺傳操作

1.1 轉(zhuǎn)化限速酶基因

轉(zhuǎn)化次生代謝產(chǎn)物合成途徑中的一個限速酶基因，克服限速步驟的影響，提高次生代謝產(chǎn)物在植物中的含量。這部分研究較多，最早的報道是 Yun等將來源于天仙子Hyoscyamus nigerLinn.的天仙子胺 6β-羥化酶 (Hyoscyamine 6βhydroxylase，H6H) 基因轉(zhuǎn)化到顛茄Atropa belladonnaLinn.中，提高顛茄中東莨菪堿的含量[6]。以后，越來越多代謝途徑的限速步驟和限速酶被鑒定，如萜類合成途徑中的萜類合酶(Terpenoid synthase，TS)，吲哚生物堿合成途徑中的異胡豆苷合酶 (Strictosidine synthase，STR)，莽草酸途徑中的苯丙氨酸脫氨酶 (Phenylalanine ammonia lyase，PAL)，青蒿素合成途徑中的紫穗槐二烯合酶 (Amorpha-4,11-diene synthase，ADS)等，并克隆了它們的編碼基因，利用轉(zhuǎn)化限速酶基因提高次生代謝產(chǎn)物含量的報道也越來越多[7-8]。反義抑制[9]、共抑制[10]或 RNA 干擾技術(shù)[11-12]也逐漸用于抑制或關(guān)閉競爭性分支代謝途徑，從而提高目標(biāo)代謝物的含量；有時也用于抑制不利代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[13-14]。

1.2 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子基因

提高原植物中轉(zhuǎn)錄因子的豐度，或引入外源轉(zhuǎn)錄因子，對代謝途徑相關(guān)酶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[15]。長春花C. roseus中合成的多種萜類吲哚生物堿(Terpenoid indole alkaloids，TIAs) 是重要的天然抗癌化合物。這些萜類吲哚生物堿的合成途徑受多個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，包括ORCA3轉(zhuǎn)錄因子、CrWRKY1轉(zhuǎn)錄因子和AtMYC2轉(zhuǎn)錄因子等。超表達(dá)這些轉(zhuǎn)錄因子，可以增加合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)量，顯著提高長春花C. roseus中萜類吲哚生物堿的合成量[16-17]。另外，抑制轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，也可能達(dá)到提高次生代謝產(chǎn)物含量的目的[18]。目前，已經(jīng)克隆的代謝途徑轉(zhuǎn)錄因子，大多數(shù)調(diào)控代謝途徑中部分催化酶基因的表達(dá)，獲得可以調(diào)控整條途徑中多個乃至全部催化酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子具有重要意義[19]。有時，由于限速步驟的存在，對轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行遺傳操作時，次生代謝產(chǎn)物含量增加的效果不明顯[20]。

1.3 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因

針對代謝途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (Transporter) 基因進(jìn)行遺傳操作，協(xié)助底物、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物等代謝成分運(yùn)輸?shù)秸_的細(xì)胞類型和細(xì)胞器內(nèi)，避免反饋抑制和細(xì)胞毒性，從而提高代謝產(chǎn)物含量。植物代謝的中心途徑發(fā)生在一種細(xì)胞類型或細(xì)胞器中，而分支代謝途徑可能發(fā)生在其他細(xì)胞類型或細(xì)胞器內(nèi)，各中間產(chǎn)物在不同類型的細(xì)胞或細(xì)胞器間經(jīng)過轉(zhuǎn)運(yùn)，最終合成終產(chǎn)物[21]。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在次生代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸與貯存過程中發(fā)揮重要的作用[22]。目前，對轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行遺傳操作，從而調(diào)控次生代謝途徑的研究報道不多。長春花C. roseus中的四氫蛇根堿 (Ajmalicine)可用于治療高血壓，而四氫鴨腳木堿(Tetrahydroalstonine) 具有持久的降血糖作用。最近，有研究表明，超表達(dá)ABC transporter (ATP-binding cassette transporter) 基因，可以提高長春花中四氫蛇根堿和四氫鴨腳木堿的積累量[23]。

1.4 轉(zhuǎn)化單鏈抗體基因

轉(zhuǎn)入活性成分的單鏈抗體 (Single chain fragments variable，scFv) 基因，提高代謝成分產(chǎn)量。田中宏幸等針對藥用植物喀西茄Solanum khasianumJacquem.中的藥理活性成分澳洲茄堿糖苷制作了單克隆抗體[24]，再從分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取 RNA，擴(kuò)增出抗體的重鏈可變區(qū)(The variable，heavy chain domain，VH) 和輕鏈可變區(qū) (The variable，light chain domain，VL) 序列，通過彈性多肽接頭穩(wěn)定地連接在一起，構(gòu)成scFv。在抗體序列N端添加一段內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號序列，C端添加一段含有終止子的KDEL序列后，插入到發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA中，轉(zhuǎn)化到喀西茄植株內(nèi)，誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根。在毛狀根中檢測到 scFv抗體的表達(dá)，同時，澳洲茄堿糖苷的產(chǎn)量較未轉(zhuǎn)化的毛狀根上升了3倍，與scFv的表達(dá)水平呈正相關(guān)[25]。絕大多數(shù)藥用植物的活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)未知或復(fù)雜，因而難以合成，并且生物合成途徑還未闡明，如紫杉醇、人參皂苷、甘草皂苷等，采用該方法有助于提高產(chǎn)量，并可望逐漸發(fā)展成為一種新的分子育種方法[26]。

除了以上方法，縮短植物生長期；超表達(dá)代謝途徑中催化酶的抗體[27]；利用核酶技術(shù)，關(guān)閉轉(zhuǎn)錄后生物合成途徑[28]，從而抑制分支或競爭性代謝途徑等，這些方法也可以用于代謝途徑的遺傳操作，提高次生代謝產(chǎn)物的含量。

2 針對多個基因進(jìn)行遺傳操作

大多數(shù)植物次生代謝途徑由多個反應(yīng)步驟組成。對其中的一個限速步驟進(jìn)行遺傳操作，可能增加該步驟及其下游中間產(chǎn)物的產(chǎn)量，但由于缺乏對上游或后續(xù)限速步驟中催化酶的誘導(dǎo)，有時未必有效。另外，利用植物反應(yīng)器生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物時，有時需要向原本不具備這一代謝途徑的植物中引入新的途徑，常常需要針對多個基因進(jìn)行遺傳操作。多基因操作是植物代謝途徑改造的一個重要發(fā)展方向，也是具有廣闊應(yīng)用前景的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。目前，主要采取以下策略。

2.1 有性雜交策略

分別轉(zhuǎn)化代謝途徑各催化步驟中的單個基因，獲得純合的轉(zhuǎn)基因后代，再通過轉(zhuǎn)基因后代的有性雜交，將多個基因聚合，最終獲得轉(zhuǎn)化了多個目標(biāo)基因并穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系。這方面的報道較多[29-30]。有學(xué)者將富養(yǎng)產(chǎn)堿菌Alcaligeneseutrophus中由乙酰輔酶 A合成聚(R)-(-)-3-羥基丁酸鹽 (Poly[(R)-(-)-3-hydroxybutyrate]，PHB)途徑的3個酶基因，分別添加了一段豌豆葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，轉(zhuǎn)化到擬南芥中，再進(jìn)行有性雜交，獲得轉(zhuǎn)化了3個基因的后代，將轉(zhuǎn)基因后代中的PHB含量提高了 100倍[31]。這種方法是從大量的轉(zhuǎn)基因后代群體中篩選表達(dá)穩(wěn)定、單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過2～3個世代的自交后獲得純合的后代，用做基因聚合的親本。每聚合一個基因需要經(jīng)過2～3代才能獲得純合的植株，若是需要聚合3～4個外源基因，則需要經(jīng)過4～6代。當(dāng)需要聚合的基因數(shù)目較多時，由于分離方式復(fù)雜，有時無法獲得聚合了全部外源基因的純合植株。另外，在每一個育種世代中，都要篩選外源基因持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)的個體，還要保證所有外源基因能夠持續(xù)多代穩(wěn)定表達(dá)。因此，這種方法的育種群體規(guī)模大，育種周期長，篩選工作量大。采用這種策略轉(zhuǎn)化多個基因的反義序列或正義片段，可以抑制或關(guān)閉競爭性代謝途徑，提高目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物含量；但通常靶基因的活性被抑制80%以上時，植物才能表現(xiàn)出相應(yīng)的生理表型變化，或表現(xiàn)出明顯的代謝產(chǎn)物含量降低的變化，因此，篩選轉(zhuǎn)基因后代的難度大。

2.2 再轉(zhuǎn)化策略

以轉(zhuǎn)化了代謝途徑中某一個催化酶基因的轉(zhuǎn)基因后代為受體，進(jìn)行再次轉(zhuǎn)化[32]，最終獲得聚合了多個催化酶基因的轉(zhuǎn)基因后代。該策略尤其適用于那些不可能或不方便通過有性雜交獲得多基因聚合后代的植物，如木本植物。有學(xué)者將肉桂醇脫氫酶 (Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD) 和咖啡酸/5-羥基阿魏酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶 (Caffeic acid/5-hydroxyferulic acid O-methyltransferase，COMT) 的反義基因先后轉(zhuǎn)化到楊樹中[33]，期望通過遺傳操作改變楊樹的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，從而生產(chǎn)工業(yè)紙漿。與前一種方法相比，這種方法同樣需要大量的篩選工作，實(shí)驗(yàn)周期更長。而且再轉(zhuǎn)化容易誘發(fā)轉(zhuǎn)基因沉默。另外，再轉(zhuǎn)化時采用的標(biāo)記基因必須與上一次轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因不同，這樣才有利于后代的篩選。當(dāng)待轉(zhuǎn)化外源基因的數(shù)目較多時，較難獲得足夠的標(biāo)記基因，有時需要移除上一代的選擇標(biāo)記，但這無疑會增加工作量。

2.3 共轉(zhuǎn)化策略

將代謝途徑各步驟的催化酶基因構(gòu)建在不同的載體上，通過共轉(zhuǎn)化獲得多基因轉(zhuǎn)化的后代。這種方法已經(jīng)用于多種植物次生代謝途徑調(diào)控。有學(xué)者給八氫番茄紅素合酶 (Phytoene synthase，PSY) 基因、八氫番茄紅素脫飽和酶(Phytoene desaturase, CRTⅠ) 基因和番茄紅素環(huán)化酶 (Lycopene β-cyclase，LCY) 基因附加了不同的啟動子和質(zhì)體定位信號，共轉(zhuǎn)化后表達(dá)在水稻胚乳中，獲得胚乳中可產(chǎn)生維生素A原的轉(zhuǎn)基因金米[34]。此后，另有學(xué)者利用不同的胚乳特異性啟動子，將八氫番茄紅素合酶 1 (Phytoene synthase 1，PSY1) 基因、八氫番茄紅素脫飽和酶 1 (Phytoene desaturase，CRT I) 基因、β-胡蘿卜素酮化酶 (β-carotene ketolase，CRT W) 基因、番茄紅素 β-環(huán)化酶 (Lycopene β-cyclase，LYCb)基 因 和 β-胡 蘿 卜 素 羥 化 酶 (β-carotene hydroxylase，BCH) 基因等5個基因通過基因槍方法，共轉(zhuǎn)化到白玉米的胚乳中，獲得轉(zhuǎn)化了不同基因及其組合的后代群體，也為類胡蘿卜素生物合成途徑的解析創(chuàng)造了有價值的研究材料[35]。類胡蘿卜素合成是植物體內(nèi)重要的次生代謝之一，該途徑以異戊烯基焦磷酸為前體，在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶 (IPP isomerase，IPI)牻、 牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶 (GGPP synthase，GGPS)等系列催化酶的作用下，生成多種多樣的類胡蘿卜素分子[36]。我們已經(jīng)從藥用植物梔子Gardenia jasminoidesEllis.的果實(shí)中克隆了該途徑中 PSY(GenBank Accession No. JQ690895)、八氫番茄紅素脫飽和酶 (Phytoene desaturase，PDS) (GenBank Accession No. JQ690896)、7,9,9′-順式鏈孢紅素脫飽和酶 (7,9,9′-cis-neurosporene desaturase，ZDS)(GenBank Accession No. JQ690897)、胡蘿卜素順反異構(gòu)酶 (Carotene cis-trans isomerase，CRTISO)(GenBank Accession No. JQ690898)、番茄紅素b-環(huán) 化 酶 (Lycopene-b-cyclase, LYC) (GenBank Accession No. JQ690899) 和b-環(huán)羥化酶 (b-ring hydroxylase, b-OHase) (GenBank Accession No.JQ690900) 等6個酶基因的保守區(qū)段，為今后進(jìn)行胡蘿卜素生物合成途徑的調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。在水稻中的研究表明，多個基因共轉(zhuǎn)化時，T-DNAs重復(fù)整合在基因組同一位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因后代比例很高，整合了全部外源基因的轉(zhuǎn)基因植株比例可以達(dá)到40%～70%[37]。但隨著外源基因數(shù)目的增加，篩選出包含所有目的基因、所有目的基因均整合在同一位點(diǎn)、各基因表達(dá)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株的可能性大大降低。另外，共轉(zhuǎn)化對實(shí)驗(yàn)技術(shù)的要求較高。

2.4 轉(zhuǎn)錄單位策略

每個催化酶基因構(gòu)建一個轉(zhuǎn)錄單位，每個轉(zhuǎn)錄單位均包括啟動子、編碼區(qū)、終止序列和其他順式調(diào)控元件。將這些轉(zhuǎn)錄單位 (方向可以相同，也可以相反) 連接到一個轉(zhuǎn)基因載體上，通過單次轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，獲得轉(zhuǎn)化了代謝途徑中多個催化酶基因的植株。將這種策略與共轉(zhuǎn)化聯(lián)合使用，有助于克服載體容量的限制，獲得轉(zhuǎn)化了多個外源基因的植株，該策略已經(jīng)成功用于轉(zhuǎn)基因黃金水稻的培育[34]。有研究表明，這種方法更有利于獲得較為一致的外源基因表達(dá)水平。但也有研究表明，各轉(zhuǎn)錄單位中外源基因的表達(dá)水平顯著不同[38]，轉(zhuǎn)錄單位在T-DNA中的排列順序影響外源基因的表達(dá)。構(gòu)建這種轉(zhuǎn)基因載體時，使用相同的組成型啟動子，對外源基因的表達(dá)沒有影響。但一個大的重組質(zhì)粒上，存在多個相同的啟動子或終止子元件，必然影響質(zhì)粒在工程菌中和植物中的穩(wěn)定性；重組質(zhì)粒所包含的重復(fù)序列整合到受體植物基因組后，穩(wěn)定性如何，也需進(jìn)一步研究。

2.5 多順反子策略

將代謝途徑中多個催化酶基因的編碼區(qū)合并構(gòu)成多順反子，再與啟動子、終止序列和其他順式調(diào)控元件共同構(gòu)成一個轉(zhuǎn)錄單位，構(gòu)建成重組載體，轉(zhuǎn)化到植物體內(nèi)。多順反子在植物體內(nèi)被翻譯成聚多肽 (Polyproteins)。事實(shí)上，以聚多肽形式表達(dá)出多種蛋白質(zhì)，是許多病毒固有的一種機(jī)制，尤其是許多正鏈RNA病毒。病毒翻譯出多聚蛋白質(zhì)分子以后，由剪切蛋白酶將該分子剪切成單個的蛋白質(zhì)分子。目前，已經(jīng)鑒定了許多剪切蛋白酶，破譯了它們識別位點(diǎn)的特征，并應(yīng)用到植物多基因表達(dá)系統(tǒng)中。其中，口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV) 基因組中的2A序列[39-40]長度為19個氨基酸，它可以通過削弱剪切位點(diǎn)兩側(cè)甘氨酸和脯氨酸殘基之間肽鍵的正常形成，發(fā)揮剪切作用，介導(dǎo)病毒自身C-末端2A區(qū)域蛋白質(zhì)的剪切或聚多肽解離。剪切不依賴酶的作用，也不會影響翻譯的正常進(jìn)行[41]。來源于不同病毒的2A序列長度范圍僅為16～20個氨基酸，它們在轉(zhuǎn)基因植物中也可以發(fā)揮剪切功能，因而具有較為廣泛的應(yīng)用前景[42]。根據(jù)這一原理，將2A序列的編碼區(qū)置于多個目標(biāo)基因的編碼區(qū)之間，表達(dá)的聚多肽在2A序列的作用下，可以在植物體內(nèi)發(fā)生解離。解離后，2A序列殘留在前一個蛋白質(zhì)的C-末端，一個脯氨酸殘基殘留在2A序列后面的蛋白質(zhì)上。這些序列殘留一般不會影響蛋白質(zhì)正常功能的發(fā)揮。聚多肽中的蛋白質(zhì)分子各自攜帶不同的亞細(xì)胞定位信號時，2A序列能正常發(fā)揮功能；2A序列也不會干擾聚多肽中的蛋白質(zhì)分子向各自細(xì)胞器中的定位[43]。目前，2A序列已經(jīng)應(yīng)用于植物次生代謝途徑的遺傳操作。例如，蝦青素、角黃素和玉米黃素均為有高度營養(yǎng)價值的著色劑和食品添加劑，高等植物不能合成這些化合物及其中間產(chǎn)物。根據(jù)2A序列的特性，有學(xué)者將胡蘿卜素 4,4-氧化酶 (Carotene 4,4-oxygenase，CRTW) 基因和胡蘿卜素 3,3-羥化酶(3,3-hydroxylase，CRTZ) 基因轉(zhuǎn)化到煙草和馬鈴薯的質(zhì)體中，兩個基因編碼的融合蛋白通過 2A序列連接，成功地在高等植物中構(gòu)建了蝦青素、角黃素合成途徑，在轉(zhuǎn)基因煙草花朵中檢測到較高數(shù)量的蝦青素、角黃素和 4-酮基玉米黃素(4-ketozeaxanthin)[44]。還有學(xué)者利用線粒體定位信號和 2A序列，將紫穗槐-4,11-二烯合酶(Amorpha-4,11-diene synthase，ADS)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A 還原酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)、法呢基二磷酸合酶 (Farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PS)和紫穗槐-4,11-二烯單加氧酶 (Amorpha-4,11-diene monooxygenase，CYP71AV1) 基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到煙草中，引入了青蒿素前體物質(zhì)——青蒿酸的生物合成途徑[45]。

除了2A序列以外，馬鈴薯Y病毒組中編碼煙草葉脈斑點(diǎn)病毒 (Tobacco vein mottling virus,TVMV) 或煙草缺刻病毒 (Tobacco etch virus,TEV) 的NIa蛋白酶也可以作為基因之間的連接肽，用于多基因轉(zhuǎn)化，該酶分子量為48 kDa，可識別并切割特異的七肽序列位點(diǎn)。將NIa蛋白酶的編碼序列 (NIa蛋白酶基因位于功能基因上游更有利于其作用的發(fā)揮) 與功能基因的編碼序列連接在一起，并與啟動子、終止序列和其他調(diào)控序列連接，構(gòu)成一個轉(zhuǎn)錄單位，在功能基因的編碼序列兩側(cè)引入NIa蛋白酶識別位點(diǎn) (該識別位點(diǎn)一般位于C末端，第4～20個氨基酸之間，視所用蛋白酶的性質(zhì)而定)。翻譯出聚多肽以后，融合蛋白質(zhì)分子被聚多肽自身內(nèi)部編碼的蛋白酶加工、剪切，釋放出單個蛋白質(zhì)分子[46]。盡管剪切酶對聚多肽的剪切效率很高，但這種方法轉(zhuǎn)化的功能基因在植物中的表達(dá)水平普遍不高。原因可能在于，NIa蛋白酶具有一個細(xì)胞核定位信號，它可能會引導(dǎo)一部分聚多肽定位到細(xì)胞核內(nèi)，造成蛋白質(zhì)翻譯的提前終止[47]。另外，雖然所有基因的編碼序列位于同一個轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)，但各基因的表達(dá)量并不相同，它們在聚多肽中的排列位置明顯影響各自的表達(dá)水平和穩(wěn)定性。即使將核定位信號從NIa蛋白酶中移除，聚多肽中各基因的表達(dá)量也未必相同[48]。這種方法用于在葉綠體中表達(dá)多個基因時，比較有利。在聚多肽之前加上一段葉綠體基因的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，可以引導(dǎo)部分聚多肽定位在葉綠體中，并進(jìn)行加工[47]。鳳仙花Impatiens balsaminaL.種子中表達(dá)的多肽LP4在轉(zhuǎn)基因載體中也可以起連接肽的作用，用于聚多肽的剪切[49-50]。另外，將LP4的前9個氨基酸和2A融合起來，構(gòu)成LP4 /2A 序列，也可以用作連接肽，剪切效率比僅用LP4高[51-52]。NIa蛋白酶和多肽LP4有望發(fā)展成為有效的工具，用于植物次生代謝生物合成途徑的遺傳操作。

以上方法只需轉(zhuǎn)化一個載體，一次轉(zhuǎn)化即可獲得轉(zhuǎn)基因后代。但翻譯出的嵌合蛋白分子量較大，折疊方式可能比較復(fù)雜，影響下一步剪切；正確蛋白質(zhì)產(chǎn)物的產(chǎn)生依賴于起剪切作用的連接肽，在特殊情況下，連接肽的殘留可能會影響蛋白質(zhì)分子的功能[53]。另外，真核生物在細(xì)胞質(zhì)中以 mRNA為模板，啟動翻譯過程時，通常需要識別 RNA 5￠端的帽子結(jié)構(gòu)，組裝成一個翻譯起始復(fù)合物，才能進(jìn)行有效的翻譯。當(dāng)完成第一個順反子的翻譯起始和閱讀后，再起始就受到一定的抑制，常常使得下游順反子的表達(dá)水平相對較低。盡管在有些研究中，下游順反子的表達(dá)量不受影響[54]，但仍然有必要從技術(shù)層面上采取措施，以確保外源基因的表達(dá)量相對一致。一個有效的方法是在轉(zhuǎn)基因載體上添加植物或動物病毒反式翻譯激活因子 (Translational transactivator)[55]的編碼序列，這些翻譯激活因子可以協(xié)助并促進(jìn)下游順反子的翻譯再起始，提高下游順反子的表達(dá)量。如花椰菜花葉病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV) 或花生褪綠條紋病毒 (Peanut chlorotic streak virus, PCISV)[56]的翻譯反式激活因子，由各自的VI基因編碼。但有些情況下，基因VI的表達(dá)產(chǎn)物可能對植物的生長和發(fā)育有害[57]。

2.6 融合蛋白策略

將代謝途徑各步驟中催化酶基因的編碼序列融合在一起，與啟動子、終止子等調(diào)控序列構(gòu)成一個轉(zhuǎn)錄單位，再連接到轉(zhuǎn)基因載體上，表達(dá)出融合蛋白，該融合蛋白具有全部外源基因所編碼蛋白的功能。目前，該方法已經(jīng)有成功的報道。有學(xué)者將異黃酮合酶 (Isoflavone synthase，IFS)和查爾酮異構(gòu)酶 (Chalcone isomerase，CHI) 基因通過一個甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸序列連接到一起，加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位信號，構(gòu)建了一個雙功能融合蛋白，轉(zhuǎn)化到煙草中，使得轉(zhuǎn)基因煙草花瓣和幼嫩葉片中的金雀異黃酮 (Genistein)、異黃酮糖苷 (Genistein glycoside) 的含量比單獨(dú)轉(zhuǎn)化異黃酮合酶基因時更高[58]。這種方法用于構(gòu)建多個非同源基因的干擾載體時，具有明顯的優(yōu)勢。由于一個基因的片段即可用來沉默該基因，幾個基因的片段融合后，有時同樣能夠下調(diào)各基因的表達(dá)[59-60]。這種方法可以避免重復(fù)使用相同的啟動子，降低了轉(zhuǎn)基因當(dāng)代及后續(xù)世代中發(fā)生轉(zhuǎn)基因沉默的風(fēng)險，育種程序也大大簡化。然而，需要注意的是，有些蛋白質(zhì)分子以融合蛋白形式表達(dá)以后，未必能夠保持原來的功能。

以上策略各有優(yōu)缺點(diǎn)。通過有性雜交、再轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化聚合次生代謝途徑中的多個催化酶基因時，被轉(zhuǎn)化的基因往往整合到受體植物基因組的不同位點(diǎn)上，它們在轉(zhuǎn)基因后代中的表達(dá)情況差異很大，遺傳分離方式復(fù)雜，不利于獲得純合的后代。當(dāng)使用不同的 T-DNA分子和農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，整合情況更為復(fù)雜。利用多轉(zhuǎn)錄單位和多順反子策略進(jìn)行多基因轉(zhuǎn)化與聚合，需要的轉(zhuǎn)基因后代群體較小，所有目標(biāo)基因整合在同一個位點(diǎn)，整合模式簡單、清晰，遺傳分離方式簡單，有利于獲得純合的后代。因此，這兩種策略應(yīng)用前景更為廣泛，更有優(yōu)勢。但利用這兩種策略進(jìn)行多基因轉(zhuǎn)化時，采用傳統(tǒng)的酶切、連接方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體時難度較大，往往缺乏足夠的、合適的酶切位點(diǎn)。最近，利用連續(xù)雜交組裝法 (Successive hybridization assembling，SHA)，人們已經(jīng)能夠?qū)⒍鄠€大片段DNA整合到同一個載體上，而不需要經(jīng)過酶切和連接步驟[61]，這種方法特別適合用于多基因轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建。

基因表達(dá)不穩(wěn)定是植物多基因轉(zhuǎn)化面臨的一個難題。多個基因整合進(jìn)入植物體后，表達(dá)水平與基因在染色體上整合的位點(diǎn)、基因本身的序列組成、轉(zhuǎn)化策略息息相關(guān)，各個基因的表達(dá)水平顯著不同。轉(zhuǎn)基因丟失、轉(zhuǎn)基因重排和轉(zhuǎn)基因沉默[62]強(qiáng)烈影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)。隨著轉(zhuǎn)基因世代的增加，基因的表達(dá)情況更為復(fù)雜。有研究表明，在功能基因兩翼或啟動子之后附加核基質(zhì)結(jié)合區(qū) (Nuclear matrix-attachment regions, MARs)，有助于穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因當(dāng)代和后續(xù)世代中功能基因在植株內(nèi)的表達(dá)水平，也有助于防止基因沉默現(xiàn)象的發(fā)生[63]。

3 展望

植物次生代謝產(chǎn)物種類繁多，在植物體內(nèi)常常數(shù)量極少甚至不穩(wěn)定，只存在于特定部位，給代謝途徑的調(diào)控增加了難度。植物次生代謝過程及代謝物的積累受到自身和環(huán)境中各種生物和非生物因素的調(diào)控，進(jìn)行遺傳操作時，必然干擾了細(xì)胞的生理狀態(tài)，以及代謝物的動態(tài)和靜態(tài)平衡。有時，代謝物超載會使得代謝途徑產(chǎn)生反饋抑制現(xiàn)象；植物也可能會激發(fā)先天性免疫機(jī)制，使得轉(zhuǎn)入的功能基因沉默。因此，植物次生代謝途徑遺傳操作具有一定的復(fù)雜性。然而，在對代謝途徑有一定了解的基礎(chǔ)上，人們已經(jīng)能夠通過遺傳操作，增加某一個或一組次生代謝成分的含量，生產(chǎn)所需要的次生代謝產(chǎn)物，或獲得具備所需要性狀的植物新品種。有研究認(rèn)為，以原植物的高產(chǎn)器官為材料，利用遺傳操作提高次生代謝產(chǎn)物含量，不容易獲得理想的結(jié)果，原因可能在于高產(chǎn)器官中這些產(chǎn)物的含量已經(jīng)飽和，改良的潛力有限；而在原本不存在目的代謝產(chǎn)物的植物中引入新的代謝途徑，常常能夠產(chǎn)生較好的結(jié)果[64]。這是一個發(fā)展前景廣闊、激動人心的研究領(lǐng)域，其中一些成果已經(jīng)商業(yè)化，申請了專利[65-68]。近期已經(jīng)進(jìn)行遺傳操作的藥用植物在文獻(xiàn)中有較為詳盡的列舉[69]。隨著基因組和代謝組等組學(xué)技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，植物次生代謝研究獲得了前所未有的機(jī)會，人們對代謝過程了解更加深入，利用系統(tǒng)生物學(xué)方法開展預(yù)見性代謝工程將會成為未來的研究趨勢[70]。

REFERENCES

[1] Liao ZH, Chen M, Gong YF, et al. Isoprenoid biosynthesis in plants: pathways, genes, regulation and metabolic engineering. J Biol Sci, 2006, 6(1):209?219.

[2] Irmler S, Schr?der G, St-Pierre B, et al. Indole alkaloid biosynthesis inCatharanthus roseus: new enzyme activities and identification of cytochrome P450 CYP72a1 as secologanin synthase. Plant J,2000, 24(6): 797?804.

[3] St-Pierre B, Vazquez-Flota FA, De Luca V.Multicellular compartmentation ofCatharanthus roseusalkaloid biosynthesis predicts intercellular translocation of a pathway intermediate. Plant Cell,1999, 11(5): 887?900.

[4] Oksman-Caldentey KM, Inzé D. Plant cell factories in the post-genomic era: new ways to produce designer secondary metabolites. Trends Plant Sci,2004, 9(9): 433?440.

[5] Cordell GA. The Alkaloids-Chemistry and Biology.San Diego: Academic Press, 1998: 257?316.

[6] Yun DJ, Hashimoto T, Yamada Y. Metabolic engineering of medicinal plants: transgenicAtropa belladonnawith an improved alkaloid composition.Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89(24):11799?11803.

[7] Forkmann G, Martens S. Metabolic engineering and applications of flavonoids. Curr Opin Biotechnol, 2001, 12(2): 155?160.

[8] Verpoorte R, Alfermann AW. Metabolic Engineering of Plant Secondary Metabolism.Kluwer Academic Publishers, 2000: 165?177.

[9] Boase MR, Lewis DH, Davies KM, et al. Isolation and antisense suppression offlavonoid 3',5'-hydroxylasemodifies flower pigments and colour in cyclamen. BMC Plant Biol, 2010, 10(1):107.

[10] Wang E, Wang R, DeParasis J, et al. Suppression of a P450 hydroxylase gene in plant trichome glands enhances natural-product-based aphid resistance. Nat Biotechnol, 2001, 19(4): 371?374.

[11] Fujii N, Inui T, Iwasa K, et al. Knockdown of berberine bridge enzyme by RNAi accumulates(S)-reticuline and activates a silent pathway in cultured California poppy cells. Transgenic Res,2007, 16(3): 363?375.

[12] Runguphan W, Maresh JJ, O'Connor SE. Silencing of tryptamine biosynthesis for production of nonnatural alkaloids in plant culture. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(33): 13673?13678.

[13] Li FL, Qiu DY, Ma XJ, et al. Suppression of taxoid 14β-hydroxylase gene expression in taxus × media via RNA interference. Chin Biotechnol, 2009,29(5): 55?60.

李鳳嵐, 邱德有, 馬小軍, 等. 利用RNAi抑制曼地亞紅豆杉細(xì)胞紫杉烷 14β-羥基化酶基因的表達(dá). 中國生物工程雜志, 2009, 29(5): 55?60.

[14] Mahmoud SS, Croteau RB. Strategies for transgenic manipulation of monoterpene biosynthesis in plants. Trends Plant Sci, 2002, 7(8):366?373.

[15] Butelli E, Titta L, Giorgio M, et al. Enrichment of tomato fruit with health-promoting anthocyanins by expression of select transcription factors. Nat Biotechnol, 2008, 26(11): 1301?1308.

[16] Suttipanta N, Pattanaik S, Kulshrestha M, et al. The transcription factor CrWRKY1 positively regulates the terpenoid indole alkaloid biosynthesis inCatharanthus roseus. Plant Physiol, 2011, 157(4):2081?2093.

[17] Montiel G, Zarei A, K?rbes AP, et al. The jasmonate-responsive element from the ORCA3 promoter fromCatharanthus roseusis active inArabidopsisand is controlled by the transcription factor AtMYC2. Plant Cell Physiol, 2011, 52(3):578?587.

[18] Davuluri GR, van Tuinen A, Fraser PD, et al.Fruit-specific RNAi-mediated suppression ofDET1enhances carotenoid and flavonoid content in tomatoes. Nat Biotechnol, 2005, 23(7): 890?895.

[19] Gantet P, Memelink J. Transcription factors: tools to engineer the production of pharmacologically active plant metabolites. Trends Pharmacol Sci,2002, 23(12): 563?569.

[20] Memelink J, Verpoorte R, Kijne JW.ORCAnization of jasmonate-responsive gene expression in alkaloid metabolism. Trends Plant Sci, 2001, 6(5): 212?219.

[21] Yazaki K, Sugiyama A, Morita M, et al. Secondary transport as an efficient membrane transport mechanism for plant secondary metabolites.Phytochem Rev, 2008, 7(3): 513?524.

[22] Kutchan TM. A role for intra- and intercellular translocation in natural product biosynthesis. Curr Opin Plant Biol, 2005, 8(3): 292?300.

[23] Pomaha?ová B, Du?ek J, Du?ková J, et al.Improved accumulation of ajmalicine and tetrahydroalstonine inCatharanthuscells expressing an ABC transporter. J Plant Physiol,2009, 166(13): 1405?1412.

[24] Ishiyama M, Shoyama Y, Murakami H, et al.Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine.Cytotechnology, 1996, 18(3): 153?158.

[25] Putalun W, Taura F, Qing W, et al. Anti-solasodine glycoside single-chain Fv antibody stimulates biosynthesis of solasodine glycoside in plants. Plant Cell Rep, 2003, 22(5): 344?349.

[26] Verpoorte R, Alfermann AW, Johnson TS.Applications of Plant Metabolic Engineering. New York: Springer, 2007: 283?295.

[27] Whitelam GC, Cockburn W. Antibody expression in transgenic plants. Trends Plant Sci, 1996, 1(8):247?248.

[28] Rossi JJ. Controlled, targeted, intracellular expression of ribozymes: progress and problems.Trends Biotechnol, 1995, 13(8): 301?306.

[29] Guillet G, Poupart J, Basurco J, et al. Expression of tryptophan decarboxylase and tyrosine decarboxylase genes in tobacco results in altered biochemical and physiological phenotypes. Plant Physiol, 2000, 122(3): 933?944.

[30] Lücker J, Schwab W, van Hautum B, et al.Increased and altered fragrance of tobacco plants after metabolic engineering using three monoterpene synthases from lemon. Plant Physiol,2004, 134(1): 510?519.

[31] Nawrath C, Poirier Y, Somerville C. Targeting of the polyhydroxybutyrate biosynthetic pathway to the plastids ofArabidopsis thalianaresults in high levels of polymer accumulation. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(26): 12760?12764.

[32] Tattersall DB, Bak S, Jones PR, et al. Resistance to an herbivore through engineered cyanogenic glucoside synthesis. Science, 2001, 293(5536):1826?1828.

[33] Lapierre C, Pollet B, Petit-Conil M, et al. Structural alterations of lignins in transgenic poplars with depressed cinnamyl alcohol dehydrogenase or caffeic acid O-methyltransferase activity have an opposite impact on the efficiency of industrial kraft pulping. Plant Physiol, 1999, 119(1): 153?164.

[34] Ye XD, Al-Babili S, Kl?ti A, et al. Engineering the provitamin A (β-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science,2000, 287(5451): 303?305.

[35] Zhu CF, Naqvi S, Breitenbach J, et al.Combinatorial genetic transformation generates a library of metabolic phenotypes for the carotenoid pathway in maize. Proc Natl Acad Sci USA, 2008,105(47): 18232?18237.

[36] Giuliano G, Tavazza R, Diretto G, et al. Metabolic engineering of carotenoid biosynthesis in plants.Trends Biotechnol, 2008, 26(3): 139?145.

[37] Maqbool SB, Christou P. Multiple traits of agronomic importance in transgenic indica rice plants: analysis of transgene integration patterns,expression levels and stability. Mol Breeding,1999, 5(5): 471?480.

[38] Peach C, Velten J. Transgene expression variability(position effect) of CAT and GUS reporter genes driven by linked divergent T-DNA promoters. Plant Mol Biol, 1991, 17(1): 49?60.

[39] Ryan MD, King AMQ, Thomas GP. Cleavage of foot-and mouth disease virus polyprotein is mediated by residues within a 19 amino acid sequence. J Gen Virol, 1991, 72(Pt 11):2727?2732.

[40] de Felipe P, Luke GA, Hughes LE, et al.Eunumpluribus: multiple proteins from a self-processing polyprotein. Trends Biotechnol, 2006, 24(2):68?75.

[41] Ryan MD, Donnelly MLL, Lewis A, et al. A model for nonstoichiometric, cotranslational protein scission in eukaryotic ribosomes. Bioorg Chem,1999, 27(1): 55?79.

[42] Halpin C, Cooke SE, Barakate A, et al.Self-processing 2A-polyproteins-a system for co-ordinate expression of multiple proteins in transgenic plants. Plant J, 1999, 17(4): 453?459.

[43] El Amrani A, Barakate A, Askari BM, et al.Coordinate expression and independent subcellular targeting of multiple proteins from a single transgene. Plant Physiol, 2004, 135(1): 16?24.

[44] Ralley L, Enfissi EMA, Misawa N, et al. Metabolic engineering of ketocarotenoid formation in higher plants. Plant J, 2004, 39(4): 477?486.

[45] van Herpen TWJM, Cankar K, Nogueira M, et al.Nicotiana benthamianaas a production platform for artemisinin precursors. PLoS ONE, 2010, 5(12):e14222.

[46] Dasgupta S, Collins GB, Hunt AG. Co-ordinated expression of multiple enzymes in different subcellular compartments in plants. Plant J, 1998,16(1): 107?116.

[47] Marcos JF, Beachy RN. Transgenic accumulation of two plant virus coat proteins on a single self-processing polypeptide. J Gen Virol, 1997,78(Pt 7): 1771?1778.

[48] Ceriani MF, Marcos JF, Hopp HE, et al.Simultaneous accumulation of multiple viral coat proteins from a TEV-NIa based expression vector.Plant Mol Biol, 1998, 36(2): 239?248.

[49] Tailor RH, Acland DP, Attenborough S, et al. A novel family of small cysteine-rich antimicrobial peptides from seed ofimpatiens balsaminais derived from a single precursor protein. J Biol Chem, 1997, 272(39): 24480?24487.

[50] Jha S, Chattoo BB. Transgene stacking and coordinated expression of plant defensins confer fungal resistance in rice. Rice, 2009, 2(4):143?154.

[51] Fran?ois IEJA, Van Hemelrijck W, Aerts AM.Processing inArabidopsisthalianaof a heterologous polyprotein resulting in differential targeting of the individual plant defensins. Plant Sci, 2004, 166(1): 113?121.

[52] Zhang B, Rapolu M, Huang LY, et al. Coordinate expression of multiple proteins in plant cells by exploiting endogenous kex2p-like protease activity.Plant Biotechnol J, 2011, 9(9): 970?981.

[53] Dafny-Yelin M, Tzfira T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol, 2007,145(4): 1118?1128.

[54] Blumenthal T. Gene clusters and polycistronic transcription in eukaryotes. BioEssays, 1998, 20(6):480?487.

[55] Bonneville JM, Sanfa?on H, Fütterer J, et al.Posttranscriptionaltrans-activation in cauliflower mosaic virus. Cell, 1989, 59(6): 1135?1143.

[56] Maiti IB, Richins RD, Shepherd RJ. Gene expression regulated by gene VI of caulimovirus:transactivation of downstream genes of transcripts by gene VI of peanut chlorotic streak virus in transgenic tobacco. Virus Res, 1998, 57(2):113?124.

[57] Cecchini E, Gong ZH, Geri C, et al. TransgenicArabidopsislines expressing gene VI from cauliflower mosaic virus variants exhibit a range of symptom-like phenotypes and accumulate inclusion bodies. Mol Plant Microbe Interact, 1997, 10(9):1094?1101.

[58] Tian L, Dixon RA. Engineering isoflavone metabolism with an artificial bifunctional enzyme.Planta, 2006, 224(3): 496?507.

[59] Seymour GB, Fray RG, Hill P, et al.Down-regulation of two non-homologousendogenous tomato genes with a single chimaeric sense gene construct. Plant Mol Biol, 1993, 23(1):1?9.

[60] Jones CG, Scothern GP, Lycett GW, et al. The effect of chimeric transgene architecture on co-ordinated gene silencing. Planta, 1998, 204(4):499?505.

[61] Jiang XL, Yang JM, Zhang HB, et al.In vitroassembly of multiple DNA fragments using successive hybridization. PLoS ONE, 2012, 7(1):e30267.

[62] Finnegan J, McElroy D. Transgene inactivation:plants fight back. Nat Biotechnol, 1994, 12(9):883?888.

[63] Allen GC, Spiker S, Thompson WF. Use of matrix attachment regions (MARs) to minimize transgene silencing. Plant Mol Biol, 2000, 43(2/3): 361?376.

[64] Fraser PD, Romer S, Shipton CA, et al. Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-specific manner. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(2):1092?1097.

[65] Holton T. Transgenic plants exhibiting altered flower color and methods for producing same: US,6080920. 2000-06-27.

[66] Holton T, Tanaka Y. Transgenic plants having altered anthocyann levels: US, 5948955.1999-09-07.

[67] Koes R, De Vetten N, Mol J. Cytochrome b5 from Petunia: PCT-International Patent Application. WO 00/09720. 2000-02-24.

[68] Vainstein A, Zuker A, Ovadis M. Transgenic plants and method for transforming carnations:PCT-International Patent Application. US,7129393. 2006-10-31.

[69] Ranalli P. Improvement of Crop Plants for Industrial End Uses. New York: Springer, 2007:475.

[70] Chen XY. Plant secondary metabolism. World Sci-Tech R & D, 2006, 28(5): 1?4.

陳曉亞. 植物次生代謝研究. 世界科技研究與發(fā)展, 2006, 28(5): 1?4.

Genetic modification of secondary metabolite biosynthesis in higher plants: a review

Xiaoyun Wang1, Xunli Xia1, Fenglan Huang2, and Shouwen Zhang1

1Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine,Chinese Medicine Germplasm Resource Engineering Technology Research Center of Jiangxi Province,Nanchang330004,Jiangxi,China
2College of Life Science,Inner Mongolia University for the Nationalities,Tongliao028000,Inner Mongolia,China

Received:March 15, 2012;Accepted:May 4, 2012

Supported by:Research Foundation of Education Bureau of Jiangxi Province (No. GJJ11542), National Project Application in the 12th Five-Year Period (No. 2011BAI04B01), Ph.D Programs Foundation of Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine (No. 530046).

Corresponding author:Shouwen Zhang. Tel: +86-791-87118994; E-mail: wtzsw@163.com

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 (No. GJJ11542)，國家十二五科技支撐計劃 (No. 2011BAI04B01)，江西中醫(yī)學(xué)院博士啟動基金課題 (No.530046) 資助。