RNA干擾及其在肝癌治療中的研究進展*

陳啟斌 莢衛(wèi)東

自1998年由Fire等[1]首次發(fā)現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象以來，RNA干擾技術(shù)發(fā)展迅速，RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指由與靶基因序列同源的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引發(fā)的廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程。

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，是多因素、多階段、多基因相互作用的結(jié)果，包括病毒感染、致癌物的作用、癌基因的激活和抑癌基因的失活、細胞的凋亡和增殖調(diào)節(jié)失控、修復(fù)基因結(jié)構(gòu)和功能缺陷等[2]。在其癌變、增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等一系列過程中伴隨著不同階段的癌基因或抑癌基因變異，引起相關(guān)因子表達的紊亂。針對這些生物學(xué)特性，已經(jīng)有許多RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于肝癌的基因治療與研究。RNAi因其特有的高效性、特異性、低毒性，為肝癌基因治療的研究開辟了一條新的途徑。

一、RNAi概述

（一）RNAi的發(fā)現(xiàn) 1995年Guo等[3]人在阻斷秀麗新小桿線蟲中par-1基因表達的研究中發(fā)現(xiàn)，對照實驗組注射正義RNA不但不增加該基因的表達，反而產(chǎn)生與反義RNA同樣的結(jié)果，即特異性阻斷該基因的表達。1998年，由Fire等[1]證實，正義RNA抑制基因表達的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄的RNA中污染了少量dsRNA而引起的，并發(fā)現(xiàn)純化后的dsRNA具有比正義鏈或反義鏈更強的基因沉默效應(yīng)，故將dsRNA能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的這一現(xiàn)象首次稱為RNAi現(xiàn)象。隨后在一些植物和低等無脊椎動物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RNAi效應(yīng)存在[4]。早期研究者采用較長序列的dsRNA總是導(dǎo)致基因的非特異性抑制，以致認(rèn)為在哺乳動物細胞中是不能以RNAi技術(shù)誘導(dǎo)特異性基因抑制的[5]。2001年，Elbashir等[6]將人工合成的19-21nt的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入人胚腎細胞和Hela細胞，成功地在哺乳動物細胞產(chǎn)生了特異性的基因沉默，解決了長片段dsRNA在哺乳動物細胞內(nèi)引起非特異性干擾的問題，從此RNAi技術(shù)得以廣泛應(yīng)用于哺乳動物和人類細胞的研究。

（二）RNAi的機制與應(yīng)用 在RNAi過程中，dsRNA被特異性核酸內(nèi)切酶（dsRNA specific endonuelease，Dicer）切割成約21-23nt的短雙鏈片段[7]，即siRNA。siRNA雙鏈3’端為羥基末端，且有兩個不配對的堿基，此結(jié)構(gòu)可能對siRNA形成蛋白復(fù)合體是必須的，兩端的5’-磷酸鹽是真正的siRNA和細胞其他dsRNA賴以區(qū)分的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。另外，siRNA的5’—磷酸鹽可能充當(dāng)靶RNA裂解位點的一種分子參照[8]。由siRNA中的反義序列指導(dǎo)形成一種蛋白復(fù)合體，該蛋白復(fù)合體被稱為RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物（RNA induced silencing conplex，RISC）。siRNA作為引導(dǎo)序列引導(dǎo)RISC與同源性的mRNA結(jié)合，解旋酶催化mRNA與siRNA的正義RNA鏈相互交換，反義RNA鏈與同源mRNA結(jié)合后，核酸酶在mRNA與反義RNA所形成的雙鏈區(qū)的5’起始端下游7-10個核苷酸處（也就是雙鏈區(qū)的靠近中間位置）切斷mRNA，導(dǎo)致其降解，阻斷相應(yīng)基因的表達[9]。降解的mRNA被釋放后，siRNA雙鏈重新形成，可以繼續(xù)降解同源mRNA[10]。siRNA也可作為一種特殊引物，在RNA依賴的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）作用下，以靶mRNA為模板合成dsRNA[11]，后者再次被Dicer切割成siRNA，新生成的siRNA又可進入上述循環(huán)，這一過程稱為RNAi的放大效應(yīng)。新生成的dsRNA被反復(fù)合成與降解，不斷產(chǎn)生大量新的siRNA，從而使靶mRNA漸進性減少，有效抑制靶向基因蛋白質(zhì)或多肽合成，呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象[12]。此外，siRNA本身也可在RdRp作用下進行自我復(fù)制，使信號不斷擴大，產(chǎn)生擴增效應(yīng)，不斷引起相應(yīng)的mRNA降解。RNAi技術(shù)作為一種簡便而又高效特異的抑制靶基因表達的新技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究、抗病毒和抗腫瘤基因治療以及藥物開發(fā)等領(lǐng)域的探索之中[13]。

二、RNAi在肝癌治療研究中的應(yīng)用

（一）肝癌基因RNAi治療靶基因的選擇 通過RNAi技術(shù)作用于肝癌的發(fā)生、發(fā)展的各相關(guān)因素和多個階段中有重要作用的靶基因，調(diào)節(jié)基因間的相互作用是目前RNAi用于肝癌研究的主要方向。

RNAi在肝癌研究領(lǐng)域中可體現(xiàn)在以下幾個方面:（1）RNAi可應(yīng)用于敲除點基因突變激活的癌基因?；诟叨忍禺愋裕M管突變基因和野生型基因通常只有一個不同的堿基，RNAi仍可對突變基因產(chǎn)生抑制作用，而對正常細胞中的野生型基因不產(chǎn)生抑制作用[14]；（2）RNAi可應(yīng)用于抑制插入基因及融合基因的表達；（3）RNAi可應(yīng)用于抑制基因擴增。基因擴增是指原癌基因通過某種機制在原染色體上復(fù)制出多個拷貝數(shù)，導(dǎo)致表達產(chǎn)物異常增多，細胞增殖。設(shè)計基因擴增中起重要作用的基因siRNA或shRNA[即短發(fā)夾RNA，包含兩個短反向重復(fù)序列（其中一個與目的基因互補），中間由一個loop序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)shRNA可以被加工成siRNA，降解目的基因，可抑制目的基因表達，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖[15]；（4）RNAi可應(yīng)用于抑制其他與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達，如腫瘤多耐藥基因；（5）RNAi可針對血管生成因子及其受體；（6）等位基因特異性抑制（ASI），ASI是一針對腫瘤細胞中與缺陷基因?qū)?yīng)的正常等位基因進行治療的方法，其前提是該等位基因?qū)匐s合子并且是細胞生命活動所必需的。抑制了正常等位基因的腫瘤細胞會死亡，而正常細胞由于等位基因的代償而不受影響。

Yin等[16]采用脂質(zhì)體法將單一或組合的siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細胞、HeLa細胞、肺腺癌細胞、卵巢癌細胞和黑色素瘤細胞。結(jié)果顯示，siRNA不僅特異性清除了靶目標(biāo)如bcl-2、cdk-2、mdm-2、pkc-alpha、tgf-betal、H-ras、vegf和 GFP 的 mRNA，而且不同程度上抑制了癌細胞的增殖，從而證實這些人類腫瘤細胞內(nèi)都存在RNAi機制，他們認(rèn)為載體攜帶、化學(xué)合成的siRNA通過細胞內(nèi)RNAi體系使靶mRNA沉默，組合不同的siRNA可抑制癌細胞的增殖和生長。Li等[17]在研究IFN-gamma/LIGHT介導(dǎo)細胞凋亡信號通路機制的同時，通過RNAi手段阻斷Hep3B細胞中Bcl-XL的過表達，發(fā)現(xiàn)在Hep3B細胞中Bcl-XL的過表達能增強對IFN-gamma/LIGHT介導(dǎo)凋亡的抵抗。Wu等[18]以人工合成的miRNAs介導(dǎo)的RNAi技術(shù)下調(diào)CC趨化因子受體（CCR）1基因在肝癌細胞系HCCLM3中的表達，可抑制HCCLM3細胞的侵襲能力，CCR1基因表達下降可顯著減少基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2的分泌，后者與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

腫瘤細胞增殖所需的能量，核酸合成所需的核苷酸均由磷酸戊糖途徑直接或間接產(chǎn)生，轉(zhuǎn)酮醇酶就是這一途徑的限速酶，原癌基因轉(zhuǎn)酮醇1（transketolase-like protein 1，TKTL1）是轉(zhuǎn)酮醇酶家族中的一員，其所定位的區(qū)域包含了許多與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化和細胞周期有關(guān)的基因，在腫瘤發(fā)生發(fā)展上起到十分重要的作用[19]。Zhang等[20]通過RNAi技術(shù)在肝癌細胞中抑制TKTL1的表達，發(fā)現(xiàn)能明顯影響肝癌細胞的增殖、侵襲活力，可望成為肝癌治療的新靶點。Sun等[21]通過RNAi抑制了人肝癌細胞系Bel-7402細胞系上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變因子（Twist1）基因的表達，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯下降。Salvi等[22]通過RNAi抑制了肝細胞生長因子受體（c-Met）的表達，進而抑制了肝癌SKHep1C3細胞的轉(zhuǎn)移。陸彬彬等[23]以血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）shRNA真核表達載體轉(zhuǎn)染肝癌細胞系SMMC-7721，可阻斷大部分肝癌細胞VEGF蛋白的表達，細胞增殖能力降低，單個細胞克隆形成能力明顯下降。VEGF被公認(rèn)與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此認(rèn)為，VEGFshRNA真核表達載體可應(yīng)用于肝癌的基因治療。

（二）肝癌基因RNAi治療干擾方式的選擇

（1）化學(xué)合成的RNAi：對于瞬時基因沉默實驗，化學(xué)合成的、非載體的方法比載體法有著明顯的優(yōu)勢：化學(xué)合成的siRNA設(shè)計簡易；操作簡便；對細胞或組織的毒副作用較?。蝗菀撰@得高水平的瞬時沉默效果；特異性強；同樣的實驗條件下，在不同實驗室重復(fù)性高。但其穩(wěn)定性較差，作用時間較短。朱曉群等[24]通過化學(xué)合成骨橋蛋白特異性siRNA干擾高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株HCC-LM3，可顯著降低骨橋蛋白的表達，且抑制了肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。陳鐘等[25]化學(xué)合成了PLK1基因的siRNA，轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細胞后，可明顯抑制肝癌細胞增殖，誘導(dǎo)凋亡。

（2）載體介導(dǎo)的RNAi：基于DNA載體的siRNA可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達，其特點有：產(chǎn)生shRNA來完成RNA干擾；方法簡單、經(jīng)濟實惠，只需合成DNA寡核苷酸；克隆載體使用方便，帶有篩選標(biāo)記，可幫助建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系；shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定，易于操作。檀英霞等[26]將肝素酶短發(fā)夾式RNA（Hpa-shRNA）真核表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2（高表達Hpa）后，明顯抑制了肝素酶（Hpa）的表達，且接種于裸鼠皮下，可抑制體內(nèi)腫瘤的生長。趙岳等[27]建立靶向N-ras基因的shRNA表達載體，轉(zhuǎn)染肝癌細胞后，可明顯抑制N-ras基因的表達，且誘導(dǎo)細胞凋亡。Luo等[28]通過載體介導(dǎo)的shRNA干擾肝癌細胞中極低密度脂蛋白受體II（VLDLRII）的表達，使得肝癌細胞處于G0/G1期，抑制了細胞增殖。

（3）慢病毒介導(dǎo)的RNAi：慢病毒載體是一類重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，由于其結(jié)構(gòu)和功能的特點作為一種重要的基因轉(zhuǎn)移工具被應(yīng)用于基因治療和細胞分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，他對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。該載體可以將外源基因有效的整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。Huang等[29]通過慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)沉默Smad4基因表達，干擾了轉(zhuǎn)化生長因子β-Smad4信號傳導(dǎo)途徑，從而抑制肝癌細胞增殖，誘導(dǎo)凋亡。李俊等[30]采用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)干擾人IKKα、IKKβ基因的表達，并且觀察其對肝癌細胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)IKKα、IKKβ基因的表達被沉默后，肝癌細胞的生長明顯受到抑制。

三、展望

原發(fā)性肝癌是我國發(fā)病率和復(fù)發(fā)率較高的惡性腫瘤之一，肝癌術(shù)后的高復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率是目前肝癌治療的巨大挑戰(zhàn)。因此，研究肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機制，對于尋找有效治療方法具有重要的意義。RNAi為肝癌研究開辟了新途徑，其應(yīng)用于肝癌的治療正成為肝癌基因治療研究的新熱點。

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