鉛梯度脅迫對多年生黑麥草幼苗生理生化特性影響

劉慧芹，韓巨才，劉慧平，康欣然

（1.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西 太谷030801；2.天津農(nóng)學院園藝系，天津300384）

＊草地是畜牧業(yè)生產(chǎn)的基地，具有生態(tài)、生產(chǎn)和生活的功能［1］，但目前由于自然因素和人類活動引起的草地生態(tài)環(huán)境退化問題日益嚴重，其中重金屬污染是破壞生態(tài)環(huán)境的重要因素之一［2，3］。據(jù)報道，我國受重金屬污染的草地及耕地面積超過2 000萬hm2，土壤中的重金屬污染破壞生態(tài)平衡、降低農(nóng)作物產(chǎn)量、污染植物和危害人類健康［4］。重金屬鉛是一種劇毒的環(huán)境污染物，過量的鉛進入環(huán)境，參與水體—土壤—生物系統(tǒng)的循環(huán)，可以在植物體內(nèi)大量積累。在此背景下，人們開始應用植物修復技術清除污染、治理環(huán)境［5］。自然界存在著大量可以修復土壤和美化環(huán)境的重金屬富集植物，如錢海燕等［6］的研究發(fā)現(xiàn)黑麥草（Loliumperenne）對Cu、Zn污染土壤有一定的耐性及修復作用；Tamas和Kovacs［7］認為早熟禾（Poaannua）對Pb的吸收富集能力較強，可消除土壤中的重金屬污染；Archer和Caldwell［8］則認為普通狗牙根（Cynodondactylon）對重金屬（Pb或Cd）脅迫具有較強的耐性。植物對重金屬表現(xiàn)出富集能力的同時，也引起了自身一系列的生理特性變化，如高濃度的Pb、Cd等重金屬溶液可以降低植物抗性酶的活性，改變細胞膜透性，引起植物光合作用、呼吸作用、核酸代謝、細胞分裂等一系列生理生化過程的紊亂［9－13］。重金屬脅迫下生物體抗性機理的研究一直是重金屬污染生態(tài)學研究的重要內(nèi)容之一。如何早期檢測和預報重金屬對植物的毒害，有效地防止重金屬中毒以及篩選耐重金屬植物成為近年來國內(nèi)外研究的熱點［14，15］。

我國擁有豐富的草坪草種質(zhì)資源，但這些資源在草地生態(tài)環(huán)境修復過程中沒有得到充分的利用，造成了資源的嚴重浪費［3］。多年生黑麥草生長快、分蘗多、能耐牧，是優(yōu)質(zhì)的草原牧草。它質(zhì)地柔軟，適于冬無嚴寒、夏無酷暑的地區(qū)生長，修剪后再生力強，耐踐踏性強，因而也廣泛用于公園、庭院綠化，是城市園林建設中常用的常綠草坪草植物。而且黑麥草能與水稻（Oryzasativa）、玉米（Zeamays）、冬麥（Triticumaestivum）等作物實行草田輪作，實現(xiàn)豐產(chǎn)增收，具有維護農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的功效［16］。但在重金屬鉛脅迫下，黑麥草的生長及其相關功能必然會受到影響。為此，本研究以多年生黑麥草為試驗材料，研究了不同濃度鉛脅迫期間黑麥草抗氧化酶、細胞膜、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等生理指標的變化，反映出黑麥草對重金屬鉛脅迫的忍耐能力和受損程度，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)預報重金屬鉛的毒害效應、開展耐重金屬草坪草品種的篩選及其機理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

多年生黑麥草種子，購于天津農(nóng)業(yè)科學院園藝所。

1.2 材料的培養(yǎng)與處理

本試驗于2011年12月28日在山西農(nóng)業(yè)大學植物化學保護實驗室開始準備。挑選飽滿種子用0.2%的HgCl2消毒2 min，然后用蒸餾水充分漂洗，種在40 cm×25 cm×8 cm規(guī)格的塑料方盆中。以蛭石和草炭（1∶1）為栽培基質(zhì)，裝入方盆中，基質(zhì)高度為5～6 cm，全濃度Hoagland培養(yǎng)液進行盆栽試驗。播種前充分灌溉培養(yǎng)液至基質(zhì)達到80%飽和濕度，播后在光照培養(yǎng)箱中光（16 h、28℃、光強9 000 lx）暗（8 h、18℃）交替培養(yǎng)，每天加入適當蒸餾水使基質(zhì)保持濕潤，每5 d澆1次營養(yǎng)液。3月初，選用長勢基本一致的植株（幼苗4～5葉齡左右），分別加入0（對照），500，1 000和1 500 mg／L的硝酸鉛溶液（用1／2 Hoagland培養(yǎng)液配制），使基質(zhì)達到較濕潤狀態(tài)，連續(xù)灌溉3 d，共4個處理，每個處理3盆。分別在鉛脅迫結(jié)束后7，14，21，28 d時測量黑麥草的各項生理指標。

1.3 生理指標測定

各項生理指標測定方法分別為：超氧化物歧化酶（SOD）活性采用NBT還原法［17］，過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚比色法［17］，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法［18］，細胞膜透性采用相對電導率法［18］，可溶性糖（SS）含量采用蒽酮法［17］，脯氨酸（Pro）含量用磺基水楊酸法［17］。以上所有指標測定均重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件整理數(shù)據(jù)、方差分析，利用SPSS 16軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛脅迫對黑麥草葉片SOD活性的影響

脅迫7 d時，經(jīng)500，1 000，1 500 mg／L濃度的鉛溶液脅迫后，黑麥草葉細胞內(nèi)SOD活性均顯著高于對照（P＜0.05），且在1 000 mg／L濃度下，SOD活性上升最大，為對照的1.45倍（圖1）；14 d時，SOD活性在500 mg／L濃度下迅速上升，在整個脅迫過程中達到最高，為117.3 U／g，是對照的1.69倍，1 000 mg／L溶度下略有下降，到1 500 mg／L濃度時迅速下降，并低于對照；21和28 d時隨著鉛濃度增加，黑麥草葉片中SOD活性變化為先升后降，且在1 500 mg／L濃度下，顯著低于對照。在相同濃度下，隨著脅迫時間的延長，黑麥草葉細胞內(nèi)SOD活性也呈現(xiàn)出不同的變化。500和1 000 mg／L濃度下，SOD活性變化隨著時間延長為先升高后降低，且均在第14天時達到最高，隨后又顯著下降，在28 d時達到最低；1 500 mg／L濃度下，SOD活性隨脅迫時間增加而快速下降，在21 d時達到最低，與28 d時無顯著差異，可見高濃度下SOD活性下降速度更快，表明黑麥草對高濃度鉛的忍耐能力是有限的。

2.2 鉛脅迫對黑麥草葉片POD活性的影響

鉛脅迫7 d時，隨鉛濃度增加黑麥草葉細胞內(nèi)的POD活性表現(xiàn)為先升后降，在500 mg／L濃度下，達到最高為144.6 U／g，但與對照無顯著差異，隨之逐漸降低，在1 500 mg／L濃度下，降到最低，且顯著低于對照（P＜0.05）（圖2）。其他3 d時，POD活性呈明顯下降趨勢，在同一鉛濃度下，葉片中的POD活性隨脅迫時間延長同樣呈明顯的下降趨勢（P＜0.05），且脅迫時間越長，POD活性下降越明顯，在28 d、1 500 mg／L濃度下，POD活性降到最低，為45.9 U／g。POD活性經(jīng)方差比較得知，隨著脅迫時間及鉛濃度增加，POD活性均顯著下降。

2.3 鉛脅迫對黑麥草葉片MDA含量的影響

黑麥草MDA含量總體呈上升趨勢（圖3）。經(jīng)3個鉛濃度處理后，7 d時，黑麥草的MDA含量變化相關方程為Y＝0.151 1X＋0.655 9（r2＝0.988 5），其他3個時間依次為Y＝0.175 8X＋0.825 5（r2＝0.988 5）、Y＝0.276X＋0.592 2（r2＝0.998 7）、Y＝0.210 9X＋0.789 3（r2＝0.965 0），可見在這4個脅迫時間時，MDA含量變化與鉛濃度呈線性正相關，且增加顯著（P＜0.05）。從相關方程可知，7 d時MDA增加的趨勢最緩，而21 d時增加最明顯，且在1 500 mg／L濃度下達到1.70 nmol／g，是對照的1.93倍。相同濃度下，MDA含量與脅迫時間不呈明顯的線性關系，變化為先升后降，但高于對照。相同濃度不同時間之間、相同時間不同濃度之間以及時間和濃度之間的互作均是顯著的（P＜0.05）。

2.4 鉛脅迫對黑麥草葉片相對電導率的影響

黑麥草葉片的相對電導率總體呈上升趨勢（圖4）。7 d時，相對電導率隨鉛濃度增加而增加，但增幅相對較??；14和28 d時相對電導率的增幅明顯，而且這3 d的變化曲線相近，即在低濃度下（500和1 000 mg／L）相對電導率增加較大，而在高濃度下（1 500 mg／L）變化趨于平穩(wěn)。但在21 d時，黑麥草的相對電導率隨鉛濃度增加而增長更明顯，分別是對照的1.51，1.97，2.87倍。在低濃度下（0和500 mg／L）隨著脅迫時間延長，相對電導率變化平緩，而在高濃度（1 500 mg／L）下，相對電導率均顯著高于對照（P＜0.05）。

2.5 鉛脅迫對黑麥草葉片可溶性糖含量的影響

圖3 不同鉛濃度對黑麥草葉片MDA含量影響Fig.3 Effect of different lead concentration on MDA content in perennial ryegrass

圖4 不同鉛濃度對黑麥草葉片相對電導率影響Fig.4 Effect of different lead concentration on relative conductivity in perennial ryegrass

7和14 d時，3個濃度下的可溶性糖（SS）含量變化均為先升后降，在1 000 mg／L達到最大，而在1 500 mg／L降到最低，且低于對照（圖5）；21 d時SS含量變化波動較大，表現(xiàn)為下降—上升—下降，在1 500 mg／L降到最低；28 d時SS含量隨著鉛濃度增加而逐漸下降。各鉛濃度下，SS含量在14，21，28 d時均顯著低于第7天，到28 d時基本降到最低。表明黑麥草在遭受到了鉛脅迫后SS含量變化復雜，在較高濃度及較長時間脅迫下SS含量趨于減少。

2.6 鉛脅迫對黑麥草葉片Pro含量的影響

4個脅迫時間下，葉片中的Pro含量在不同鉛濃度脅迫下的變化趨于一致（圖6），均為在低濃度下顯著上升，而在高濃度下又顯著下降，但仍顯著高于對照（P＜0.05）。在不同鉛濃度下，隨著脅迫時間延長，Pro含量呈增長趨勢。Pro含量在1 000 mg／L濃度下均高于其他濃度，且在28 d時達到最高，為61.7μg／g，是對照的148.9%。在1 500 mg／L濃度時，Pro含量略又顯著下降，但仍高于對照，在各脅迫時間下Pro含量差異不大。表明適當?shù)你U脅迫有助于黑麥草葉片細胞內(nèi)Pro的積累，是植物對逆境的一種適應表現(xiàn)，但濃度過高就會造成傷害。

3 討論

圖5 不同鉛濃度對黑麥草葉片可溶性糖含量影響Fig.5 Effect of different lead concentration on soluble sugar content in perennial ryegrass

圖6 不同鉛濃度對黑麥草葉片脯氨酸含量影響Fig.6 Effect of different lead concentration on Pro content in perennial ryegrass

植物在逆境傷害中存在活性氧爆發(fā)（active oxygen burst）現(xiàn)象，這是植物防衛(wèi)反應機制之一，能誘導一系列的防衛(wèi)反應［19］。SOD、POD等酶是植物適應有害生物侵擾或逆境脅迫時的保護性酶類，也被稱為植物抗氧化酶系統(tǒng)，在植物受到環(huán)境脅迫時可協(xié)同清除植物體內(nèi)的自由基，從而保護膜系統(tǒng)。本研究中，SOD活性變化遵循著先升高后降低的規(guī)律，在低濃度（500和1 000 mg／L）和短時間（7和14 d）脅迫下，SOD活性顯著升高，而在高濃度（1 500 mg／L）、長時間（28 d）下，SOD活性下降，顯著低于對照。表明在低濃度脅迫早期，黑麥草的抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生適應性誘導反應，促使SOD活性快速升高，以減緩或消除污染引起的氧化脅迫，從而使之對鉛脅迫有一定的耐受能力，抗氧化能力較強，然而隨著鉛脅迫時間的延長，鉛在黑麥草體內(nèi)的積累量也增加，超過一定的積累時，細胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)就遭到了破壞，SOD活性降低，其防御功能也下降了。這與謝傳俊等［12］對假儉草（Eremochloaophiuroides），劉碧英等［20］對沿階草（Ophiopogonbodinieri）受到鉛脅迫后SOD 活性變化的研究結(jié)果一致。

POD也是植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，它能催化有毒物質(zhì)的分解，將H2O2轉(zhuǎn)化成O2和H2O，其活性的高低能反映植物受毒害的程度以及植物對逆境的適應能力。本研究中，在黑麥草經(jīng)低濃度鉛脅迫早期（7 d時），POD活性變化不大，對鉛脅迫有較好的適應能力，但隨著脅迫時間的增長以及鉛濃度的增加，POD酶活性變化呈明顯的下降趨勢。由此可知，在重金屬離子的逆境脅迫下，生物體自身有抗氧化機制，但這種能力是有限的，一定程度后這種機制會被破壞或者被其他機制替代，它們的酶活性就要下降［9］。

Bowler等［21］指出植物在干旱、污染、強輻射和重金屬等一系列逆境中都可以增強膜脂過氧化作用，增加植物體內(nèi)的活性氧，打破活性氧的代謝平衡，從而啟動膜脂質(zhì)過氧化作用或膜脫脂作用，破壞膜的結(jié)構，影響膜的功能。本研究中，鉛濃度和脅迫時間在對MDA含量的影響方面存在相互促進的效應，即鉛濃度越高，脅迫時間越長，相對電導率越高。在500 mg／L濃度下，各脅迫時間下的MDA含量就有明顯的升高，表明低濃度鉛脅迫早期，黑麥草細胞膜就發(fā)生膜脂過氧化作用，直到高濃度長時間脅迫后，膜脂過氧化作用越來越明顯，MDA含量達到最高，表明黑麥草葉片細胞膜對鉛極為敏感，易受到傷害。謝傳俊等［12］對假儉草和結(jié)縷草（Zoysiajaponica）的研究也認為葉片MDA含量隨著Pb2＋濃度的增大都有升高趨勢，尤其在高濃度下MDA的積累量更高。龐欣等［22］對小麥研究同樣認為幼苗的MDA含量與Pb2＋脅迫的程度有一定的正相關性。

隨著鉛脅迫濃度增加和脅迫時間的延長，黑麥草葉片內(nèi)細胞的相對電導率一直呈上升趨勢。相對電導率的持續(xù)上升，說明重金屬鉛對黑麥草的生理活性產(chǎn)生了嚴重的干擾，脅迫時間越久，膜的透性越大，介質(zhì)的電導率隨之升高，細胞膜的選擇透性喪失，細胞的防御能力也會隨之降低。本研究也表明了在整個脅迫過程中，脅迫濃度和時間在對相對電導率的影響方面存在相互促進的效應，即濃度越高脅迫時間越長，相對電導率升高越快。徐學華等［9］、沙翠蕓等［23］的研究也表明紅瑞木（Swidaalba）及2種彩葉植物在鎘、鉛重金屬脅迫下，其細胞的電解質(zhì)外滲量增加，植物受到的傷害增加，其含量的多少可以反映植物遭受逆境傷害的程度。

滲透調(diào)節(jié)是植物適應鹽漬、低溫、干旱、重金屬等脅迫的重要生理機制之一，在這些逆境條件下，植物通過積累一些小分子化合物，以增加細胞質(zhì)濃度，降低滲透勢，保持體內(nèi)正常生理活動的進行，從而增強植物的抗逆性［24－27］。Pro和SS是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物滲透調(diào)節(jié)中起著舉足輕重的作用?？扇苄蕴妓衔锏姆e累與植物對重金屬脅迫的適應密切相關。大量試驗表明，碳水化合物的總量與許多植物抗金屬脅迫之間存在著重要關系［23，26，28，29］。李珊等［28］的研究認為隨著鉛濃度升高，栝樓（Trichosantheskirilowii）幼苗體內(nèi) SS含量逐漸下降；而孫小霞［29］認為高濃度的鉛促使高羊茅（Festucaarundinacea）SS的積累；沙翠蕓等［23］認為紫葉李（Prunuscerasifera）、美人梅（Prunusmume）受鉛脅迫后SS含量先略有升高而后降低。因此在鉛脅迫中，不同植物體內(nèi)SS的變化是復雜的。本研究中SS含量變化則為在相同鉛濃度下，隨時間延長而遞減；在7和14 d時，SS含量變化為先增后降，21 d時為降—升—降，28 d時又持續(xù)下降，其變化各異。認為低濃度的鉛脅迫在早期（7和21 d），促使黑麥草體內(nèi)SS含量積累，表現(xiàn)出對鉛的忍耐性和積極響應，但脅迫加重后，植物更多表現(xiàn)出的是受傷后的生理變化，如同化產(chǎn)物的合成速率小于轉(zhuǎn)化、運輸速率，碳水化合物的合成路徑相對受阻等，此時也可能達到了黑麥草的生理極限忍受程度。

Pro的積累需要碳水化合物作為基礎，碳水化合物可能是通過氧化磷酸化作用為Pro的積累提供必需的氧化還原的動力［26，27］。本研究中，Pro含量在初始脅迫時就明顯高于對照，且在28 d、1 000 mg／L時含量最高，表明脅迫程度較小時，能使Pro在細胞內(nèi)快速積累，增加滲透調(diào)節(jié)能力。Pro是蛋白質(zhì)的重要組分，隨著鉛濃度一定范圍內(nèi)的增加，植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)會相應地分解，Pro的含量也會相應地增加，這與劉碧英等［20］、孫永林和劉法彬［26］的研究結(jié)果一致。因此Pro的積累是植物對鉛脅迫的一種保護性機制。但是在本研究中1 500 mg／L鉛濃度下，Pro含量下降，可能是由于鉛濃度過高時，超出植物體忍受極限，植物就會由原來的積極適應變?yōu)楸粍邮芎?，隨之其滲透調(diào)節(jié)能力降低。

因此，黑麥草在重金屬鉛脅迫下有一個積極響應和逐漸傷害受損的過程。它不僅對鉛有較強的忍耐能力，而且對鋅、銅也有很強的富集能力［6］，黑麥草這種對鉛等重金屬具有一定程度上的忍耐性及富集能力優(yōu)于其他普通植物，可作為重金屬污染地區(qū)綠化修復植物而進行深入研究。

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