毛細(xì)管電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)生物制品分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展

曹衛(wèi)榮,張世光,王曉婧,周青青,鄒 衛(wèi)

(石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)(石家莊)有限公司,河北 石家莊 050051)

毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis，CE)，又稱高效毛細(xì)管電泳(High-performance capillary electrophoresis，HPCE)，是近20年迅速發(fā)展的一種快速的分離分析技術(shù)[1]。毛細(xì)管電泳是以毛細(xì)管為分離通道，由高壓電場提供驅(qū)動力，根據(jù)待分析物質(zhì)各組分在毛細(xì)管內(nèi)淌度或分配系數(shù)的不同，即各組分沿管軸方向運(yùn)動速度的差異來實(shí)現(xiàn)對組分的分離。與傳統(tǒng)的液相色譜相比，具有高效、快速、微量、操作簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)[2～4]，利用毛細(xì)管電泳技術(shù)可以分離從離子到中性分子、從小分子到生物大分子等一系列物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域，被認(rèn)為是當(dāng)代分析科學(xué)最具活力的前沿研究領(lǐng)域。毛細(xì)管電泳技術(shù)已實(shí)現(xiàn)了納升水平分離分析，是繼高效液相色譜之后的分析化學(xué)史上又一重大進(jìn)展。

蛋白質(zhì)生物制品是當(dāng)今生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，近年來隨著DNA重組與克隆技術(shù)的飛速發(fā)展，重組蛋白類藥物的研發(fā)和生產(chǎn)成為了醫(yī)藥行業(yè)的熱門之一，但其分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此較難鑒別和定量分析，是阻礙其快速發(fā)展的主要因素。毛細(xì)管電泳技術(shù)用于蛋白質(zhì)生物制品的分析具有明顯的優(yōu)勢。作者在此就近年來國內(nèi)外毛細(xì)管電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)生物制品分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 毛細(xì)管電泳的演變

毛細(xì)管電泳最初始于瑞典籍生化學(xué)家Tiselius于1937年設(shè)計(jì)的一套分離蛋白質(zhì)的電泳裝置，因其在血清蛋白分析上的斐然成就，Tiselius于1948年獲得諾貝爾化學(xué)獎[5]。20世紀(jì)80年代是毛細(xì)管電泳技術(shù)加速發(fā)展時(shí)期，先后出現(xiàn)了熔融石英毛細(xì)管、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管等電聚焦、膠束電動毛細(xì)管色譜、毛細(xì)管電色譜。1981年，Jorgenson和Luckas用石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)[6]。1989年，第一臺商品化毛細(xì)管電泳儀問世。短短幾年內(nèi)，由于毛細(xì)管電泳符合生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)Χ嚯?、蛋白質(zhì)(包括酶、抗體)、核苷酸乃至脫氧核糖核酸(DNA)的分離分析要求，而得到了迅速發(fā)展。

2 毛細(xì)管電泳的分類

2.1 毛細(xì)管區(qū)帶電泳(Capillary zone electrophoresis，CZE)

CZE又稱自由溶液毛細(xì)管電泳，是目前毛細(xì)管電泳中最簡單、最基礎(chǔ)、應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。CZE是以具有pH值緩沖能力的電解質(zhì)溶液為載體，根據(jù)被分析物電泳淌度的不同實(shí)現(xiàn)分離。CZE的應(yīng)用范圍寬，能分離小分子藥物、氨基酸、多肽類、對映體等帶電物質(zhì)，但不能分離中性物質(zhì)。

2.2 毛細(xì)管凝膠電泳(Capillary gel electrophoresis，CGE)

CGE是將板上的凝膠移到毛細(xì)管中作支持物進(jìn)行的電泳。凝膠具有多孔性，起類似分子篩的作用，溶質(zhì)按分子大小逐一分離。CGE對于大分子物質(zhì)如抗體、蛋白多肽、寡聚核苷酸的分離分析，特別是DNA序列分析顯示了速度和效率方面的優(yōu)越性。主要缺點(diǎn)是制備較困難、壽命較短、使用時(shí)易產(chǎn)生空泡。

2.3 毛細(xì)管等電聚焦電泳(Capillary isoelectric focusing，CIEF)

CIEF是一種基于等電點(diǎn)分離生物大分子的電泳技術(shù)。通過內(nèi)壁涂層使電滲流減到最小，再將樣品和兩性電解質(zhì)混合進(jìn)樣，兩個電極槽中分別為酸和堿，加高電壓后，在毛細(xì)管內(nèi)形成了pH值梯度。溶質(zhì)遷移到相當(dāng)于其等電點(diǎn)的位置時(shí)停止，由此產(chǎn)生一個非常窄的聚集區(qū)帶，不同等電點(diǎn)的溶質(zhì)聚集在不同的位置上，形成一個個獨(dú)立的溶質(zhì)區(qū)帶而彼此分開。該電泳技術(shù)分辨率較高，主要用于分離兩性化合物。

2.4 毛細(xì)管等速聚焦電泳(Capillary isotachophresis，CITP)

CITP是基于離子淌度分離帶電離子的技術(shù)，屬于不連續(xù)介質(zhì)電泳。采用先導(dǎo)電解質(zhì)充滿整個毛細(xì)管柱，淌度高于任何樣品組分；再將尾隨電解質(zhì)置于一端的電泳槽中，淌度低于任何樣品組分。溶質(zhì)按其電泳淌度不同得以分離。該電泳技術(shù)常用作柱前濃縮以富集樣品。

2.5 毛細(xì)管膠束電動色譜(Capillary micellar electrokinetic chromatography，MEKC)

MEKC是日本Terabe等在1984年提出在緩沖溶液中加入表面活性劑十二烷基磺酸鈉而建立的。其原理是當(dāng)表面活性劑濃度超過臨界膠束濃度時(shí)，形成膠束。溶質(zhì)按照其疏水性不同在水相和膠束相之間分配而得以分離。MEKC既能分離帶電物質(zhì)又能分離中性物質(zhì)，如引入手性添加劑環(huán)糊精及其衍生物形成的手性膠束，則可進(jìn)行手性藥物的拆分分離[7]。

2.6 毛細(xì)管電色譜(Capillary electrochromatography，CEC)

CEC也稱填充柱毛細(xì)管電色譜，將HPLC中使用的眾多固定相填充到毛細(xì)管中或涂敷在毛細(xì)管壁上，毛細(xì)管兩端的高壓電相當(dāng)于高壓泵，以電滲流作為驅(qū)動力，使樣品在兩相間進(jìn)行分配得以分離。該電泳技術(shù)兼具了電泳和液相色譜的分離機(jī)制，提高了選擇性，雖然柱效較低、應(yīng)用不多，僅在免疫學(xué)、藥物分析、富勒烯化學(xué)等領(lǐng)域有所研究，但卻是一種很有發(fā)展前景的電泳技術(shù)。

3 毛細(xì)管電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)生物制品分析中的應(yīng)用

3.1 取代平板凝膠技術(shù)——CE-SDS

CE-SDS是一種高效、快速的分離分析蛋白質(zhì)生物制品的方法，用于評估蛋白質(zhì)生物制品的純度、特性和穩(wěn)定性[8]。對于蛋白質(zhì)生物制品來說，其大小異質(zhì)性程度很高[9，10]，CE-SDS是評估蛋白質(zhì)生物制品大小異質(zhì)性的一種強(qiáng)有力方法。以重組人源化單克隆抗體(rhuMAbs)為例，其大小變異體包括：游離的輕/重鏈片段、蛋白質(zhì)的斷裂片段[11]、不可分離的更高分子量的種類、二硫鍵異構(gòu)體、糖基化位點(diǎn)相關(guān)的種類等。傳統(tǒng)電泳技術(shù)不能有效檢測抗體的異質(zhì)性，而CE-SDS具備可任選擇的檢測靈敏度：UV檢測(考馬斯亮藍(lán)染色的靈敏度)、LIF檢測(銀染色的靈敏度)，能夠快速準(zhǔn)確地檢測抗體大小異質(zhì)性。另外，CE-SDS可以實(shí)現(xiàn)樣品制備自動化，大幅提高了樣品分析的效率和精確度。

最近有基于CE-SDS方法對治療性單克隆抗體(rMAb)成功進(jìn)行分析的報(bào)道[12]。rMAb標(biāo)準(zhǔn)品是一個輕鏈(LC)、非糖基化重鏈(NGHC)和重鏈(HC)的混合物。CE-SDS較強(qiáng)的分離能力主要體現(xiàn)在對HC和NGHC兩者之間的分辨率，因?yàn)镹GHC含量很低(<5%)，傳統(tǒng)方法很難準(zhǔn)確檢測。采用CE-SDS分析這些組分相對遷移時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2%，通過峰面積對這些組分進(jìn)行定量，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<9%。

大部分蛋白都存在糖基化修飾，用SDS凝膠電泳測定糖蛋白的分子量存在著困難，因?yàn)樘堑鞍椎墓烟擎湶唤Y(jié)合SDS，引起荷質(zhì)比降低，導(dǎo)致糖蛋白分子量測定不準(zhǔn)確。Ferguson分析方法指出：在不同的凝膠濃度下對糖蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，可消除寡糖對糖蛋白分子量測定的影響，這種方法在CE-SDS中同樣適用[13]。

3.2 HPLC技術(shù)的輔助手段——CZE

CZE高效、快速、簡便的特點(diǎn)使其在蛋白質(zhì)、多肽分離及純度鑒定方面應(yīng)用日益普遍，尤其是生物技術(shù)和基因工程中大量生物合成的蛋白質(zhì)、多肽能用CZE進(jìn)行有效的分離分析，以確定產(chǎn)品的純度、均一性及生產(chǎn)過程的可靠性。目前，CZE在蛋白質(zhì)和多肽分析中的用途主要包括：蛋白質(zhì)、多肽的分離及純度鑒定；蛋白質(zhì)、多肽的結(jié)構(gòu)分析；監(jiān)測蛋白質(zhì)、多肽的反應(yīng)過程及結(jié)構(gòu)變化。另外，蛋白質(zhì)生物制品電荷異質(zhì)化程度高，CZE也是快速分析蛋白質(zhì)生物制品電荷異質(zhì)性的重要手段之一[14]。Ma[15]首次使用CZE分析治療性單克隆抗體(mAbs)的電荷異質(zhì)性，使用涂層毛細(xì)管以消除蛋白質(zhì)對毛細(xì)管的吸附，結(jié)果顯示：CZE能夠快速準(zhǔn)確地分析mAbs的電荷異質(zhì)性。He等[16]使用CZE成功實(shí)現(xiàn)了幾種mAbs及其電荷異質(zhì)體的分離，并使用濃縮的兩性離子緩沖溶液以及酸性溶液來抑制電滲流和蛋白質(zhì)吸附。

高效液相色譜法在分析蛋白質(zhì)、多肽及核酸等生物大分子時(shí)，因樣品組分?jǐn)U散系數(shù)小、傳質(zhì)阻力大而導(dǎo)致分離效率較低。Aeberold設(shè)計(jì)了一種柱上電泳富集方法，使CZE適用于分析HPLC分離后濃度較低的肽段，并認(rèn)為CZE是鑒定HPLC收集的毫克級以下肽段純度最有效的方法[17]。

應(yīng)用CZE分離蛋白質(zhì)、多肽具有其獨(dú)特的優(yōu)越性，同時(shí)也存在峰容量小、難以大量制備的缺點(diǎn)，因此其并不能完全取代其它分析方法(如HPLC)，但至少是一項(xiàng)有效的補(bǔ)充手段。目前，CZE在生物大分子領(lǐng)域的分析還處于起步階段，隨著其研究和應(yīng)用的深入，CZE有望在蛋白質(zhì)、多肽等生物分子的實(shí)際分析中發(fā)揮更重要的作用。

3.3 碳水化合物分析——CE/CE-MS

由于寡糖鏈不但能參與細(xì)胞識別和分子識別，還參與糖蛋白的分揀(Sortins)和投送(Toffickins)、抗體依賴的細(xì)胞毒性[18]等細(xì)胞過程，并且在蛋白質(zhì)合成過程中由于環(huán)境條件的改變寡糖表面很容易發(fā)生改變，因此表征蛋白質(zhì)藥物上糖結(jié)構(gòu)的分析方法非常重要，但由于寡糖鏈異質(zhì)化程度高，糖基化分析具有極大的挑戰(zhàn)性。糖鏈表征的最常用技術(shù)包括HPLC、MS和CE，其中CE柱效高、分析速度快[19]，是分析蛋白質(zhì)生物制品糖基化結(jié)構(gòu)的重要手段，目前已在蛋白質(zhì)生物制品質(zhì)量控制中廣泛應(yīng)用。CE主要用于蛋白質(zhì)藥物表面的N-低聚糖、單糖的定量分析(暴露末端單糖殘基，即半乳糖和β-N-乙酰氨基葡萄糖)。Ma等[19]使用CE對利妥昔單抗(Rituximab)進(jìn)行糖基化分析，結(jié)果顯示：此方法簡便、精確度和準(zhǔn)確度高，可以用于大批量樣品日常檢測。

另外對于CE分析中小峰表征的難題，可以采用CE-MS，CE-MS不僅具有強(qiáng)大的分離能力，而且具有質(zhì)譜的靈敏度。CE-LIF-MS技術(shù)已被成功地用于微量碳水化合物樣品的直接鑒定。Gennaro等[20]用在線CE-LIF-MS 分析了來自藥用單克隆抗體(mAb)中的碳水化合物，可對微量組分進(jìn)行鑒定和定量。隨著CE與MS儀器的發(fā)展、接口技術(shù)的不斷完善，CE-MS技術(shù)必將成為生物制品碳水化合物分析強(qiáng)有力的工具，并促進(jìn)生物制品分析領(lǐng)域的迅猛發(fā)展。

3.4 檢測蛋白質(zhì)等電點(diǎn)——CIEF

每個蛋白質(zhì)都有唯一的等電點(diǎn)(pI)和/或電泳曲線圖，用已知等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行電泳，以等電值作縱坐標(biāo)、相對遷移值作橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，再得出未知物的相對遷移值，即可求其等電點(diǎn)。由于蛋白質(zhì)、多肽的電荷異質(zhì)性程度比較高，主要是由于部分糖基化、蛋白質(zhì)骨架裂解、脫酰氨基作用引起，CIEF能夠準(zhǔn)確檢測蛋白質(zhì)、多肽的電荷異質(zhì)性[21，22]，從而能夠準(zhǔn)確計(jì)算出蛋白質(zhì)、多肽樣品的純度。Ongay等[23]采用CIEF測定了來源于不同細(xì)胞的重組人源化VEGF165的pI值，并比較了昆蟲細(xì)胞和大腸桿菌表達(dá)的重組人源化VEGF165的pI值差異。

3.5 高通量的分離技術(shù)——微芯片毛細(xì)管電泳(MCE)

MCE是將CE移植到芯片上，將樣品進(jìn)樣、反應(yīng)、分離、檢測等過程集成到一起的多功能化的快速、高效、低耗微型技術(shù)。

MCE與CE相比有許多優(yōu)點(diǎn)，如進(jìn)樣量小、散熱性能好，因此允許使用較高的電場，可以大大加快分離速度，另外通過多通道設(shè)計(jì)及通道設(shè)計(jì)的任意性實(shí)現(xiàn)了芯片的高通量、集成化，目前已經(jīng)在蛋白質(zhì)分析中得到了廣泛的應(yīng)用。如Rodriguez等[24]在微芯片上采用MCE高效分離了FITC標(biāo)記的氨基酸對映異構(gòu)體等。然而，MCE還處于起步階段，技術(shù)還不成熟，但其突出的優(yōu)點(diǎn)與廣闊的應(yīng)用前景，使MCE成了分析化學(xué)一個發(fā)展迅猛的領(lǐng)域。關(guān)鍵問題仍集中于微型化、集成化、高通量和接口設(shè)計(jì)等幾個方面[25，26]，其中芯片微通道的設(shè)計(jì)布局與芯片制作技術(shù)仍將是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

4 展望

作為一種高效分離分析方法，毛細(xì)管電泳在蛋白質(zhì)生物制品分析領(lǐng)域顯示了獨(dú)特的優(yōu)勢，并得到了廣泛的應(yīng)用。隨著新型檢測器、新型分離材料、儀器微型化等方面的研究以及毛細(xì)管電泳技術(shù)與其它技術(shù)(如HPLC、MS等)的聯(lián)合應(yīng)用的進(jìn)一步深入，毛細(xì)管電泳在系統(tǒng)重現(xiàn)性、自動化程度以及檢測靈敏度方面都有了大幅提高，可以預(yù)言，毛細(xì)管電泳在未來生物制品分析領(lǐng)域中的前景會更加廣闊。其中，毛細(xì)管電色譜和微芯片毛細(xì)管電泳以其樣品微量性、分離效率高、速度快、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)將成為推動毛細(xì)管電泳技術(shù)邁向常規(guī)檢測技術(shù)的重要力量。

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