EDTA抗凝和加熱滅活補(bǔ)體對(duì)血型血清學(xué)試驗(yàn)的影響

張敬 楊君青 史國爽

鹽水法交叉配血和ABO反定型，是紅細(xì)胞血型血清學(xué)的經(jīng)典常規(guī)試驗(yàn)，因操作方便和迅速，為搶救患者爭取了時(shí)間，可檢出臨床意義最大的ABO血型抗體，其試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性常影響到受血者的生命安全，因意義重大深受臨床關(guān)注。在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，如果因某種原因延長了孵育時(shí)間，有些標(biāo)本的ABO抗體與相應(yīng)抗原紅細(xì)胞結(jié)合后會(huì)激活補(bǔ)體，導(dǎo)致溶血、凝集強(qiáng)度減弱，甚至呈假陰性結(jié)果，嚴(yán)重干擾血型血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果的正確報(bào)告［1］。為找到簡單有效地消除血型血清學(xué)試驗(yàn)中補(bǔ)體激活導(dǎo)致溶血等干擾現(xiàn)象的方法，筆者進(jìn)行了大量的試驗(yàn)。本文探討EDTA抗凝和傳統(tǒng)血清56℃加熱法對(duì)補(bǔ)體滅活及對(duì)血型血清學(xué)試驗(yàn)的影響，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選擇來我站329名健康獻(xiàn)血者，每份標(biāo)本各留2管，其中一管按照EDTA真空抗凝管抗凝能力留取一定量的血樣于抗凝管中，另一管不加任何抗凝劑。留樣后放于4℃冰箱，10 h內(nèi)檢測(cè)完畢。

1.2 儀器與試劑 KA-2200小型臺(tái)式離心機(jī)(日本久保田公司);抗人球蛋白試劑多特異性(抗IgG、C3)，單特異性(抗IgG)，單特異性(抗C3)均為上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品;抗A、抗B單克隆標(biāo)準(zhǔn)抗血清由長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供(批批檢合格，有效期內(nèi)使用);EDTA抗凝真空管江西洪達(dá)醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，抗凝能力2 ml全血。

1.3 紅細(xì)胞懸液 A型和B型獻(xiàn)血員各3名的紅細(xì)胞，等量混合后洗滌3遍，分別用0.9%氯化鈉溶液配成3% ～5% 濃度懸液。

1.4 方法 (1)試管法ABO血型定型、直接抗球蛋白試驗(yàn)、效價(jià)測(cè)定。(2)血清56℃加熱滅活處理:將血清置56℃水浴箱，孵育30 min，再進(jìn)行ABO反定型試驗(yàn)。(3)溶血反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn):抗-A或抗-B與對(duì)應(yīng)抗原紅細(xì)胞結(jié)合后，凡出現(xiàn)肉眼可見的溶血者，均判定為出現(xiàn)免疫性溶血反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 血型正定型 以試管法對(duì)329份標(biāo)本進(jìn)行ABO正定型，結(jié)果A型95份，B型108份，O型90份，AB型36份，均未出現(xiàn)溶血反應(yīng)，陽性反應(yīng)的凝集強(qiáng)度都是++++。

2.2 血清反定型

2.2.1 被檢血清2滴加紅細(xì)胞懸液1滴混合，室溫孵育10 min后離心看結(jié)果。共14例血清出現(xiàn)溶血占4.26%，其中A型4例、B型3例、O型7例;溶血標(biāo)本的紅細(xì)胞凝集強(qiáng)度明顯減弱(+～++)。在出現(xiàn)溶血反應(yīng)的7例O型標(biāo)本中有5例血清與A型和B型紅細(xì)胞均呈溶血反應(yīng)，其余2例血清有1例與A型紅細(xì)胞呈溶血反應(yīng)B型紅細(xì)胞不溶血呈強(qiáng)凝集，另外1例僅與B型紅細(xì)胞呈溶血反應(yīng)，而與A型紅細(xì)胞不溶血呈強(qiáng)凝集。

2.2.2 EDTA抗凝血漿2滴加紅細(xì)胞懸液1滴混合室溫孵育10 min后離心看結(jié)果，所有標(biāo)本管均未見溶血，凝集強(qiáng)度均≥3+。

2.2.3 取室溫出現(xiàn)溶血反應(yīng)的血清各 1 ml，放56℃ 水浴30 min滅活補(bǔ)體，補(bǔ)體滅活后血清2滴加紅細(xì)胞懸液1滴混合室溫孵育10 min后離心看結(jié)果，有一管有輕微溶血，其余未見溶血，凝集強(qiáng)度均≥+++。

2.2.4 效價(jià)測(cè)定:所有出現(xiàn)溶血反應(yīng)的14例標(biāo)本分別測(cè)定血清、EDTA抗凝血漿和56℃滅活血清的抗-A和(或)抗-B效價(jià)。結(jié)果56℃孵育后，抗-A(B)效價(jià)，下降2個(gè)滴度5管，下降1個(gè)滴度9管，效價(jià)未下降者7管;EDTA抗凝血漿效價(jià)基本與血清一致。

2.3 直接抗球蛋白試驗(yàn) 所有14例標(biāo)本直接抗球蛋白試驗(yàn)多特異性(抗IgG、C3)、單特異性(抗IgG)、單特異性(抗C3)均為陰性。

3 討論

在ABO反定型試驗(yàn)出現(xiàn)溶血反應(yīng)的標(biāo)本中O型血清出現(xiàn)溶血的比例最高且最嚴(yán)重，這可能是由于O型血清中既有抗-A，又有抗-B，且抗體效價(jià)相對(duì)較高的緣故。溶血標(biāo)本的紅細(xì)胞凝集強(qiáng)度明顯減弱［1］。

抗-A(B)溶血活性隨孵育時(shí)間和溫度升高而增強(qiáng)，它能造成紅細(xì)胞弱凝集、溶血甚至假陰性，嚴(yán)重干擾血型血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果的判定。確保立即離心能從一定程度上避免激活補(bǔ)體，但日常試驗(yàn)中由于種種原因耽誤離心，延長了紅細(xì)胞與血清孵育時(shí)間，容易激活補(bǔ)體引起溶血。

補(bǔ)體對(duì)溫度有一定的敏感性，56℃加熱30 min是經(jīng)典的補(bǔ)體滅活方法，但是本文試驗(yàn)表明，大批標(biāo)本時(shí)該方法不僅操作繁瑣、時(shí)間長，而且可能會(huì)有少數(shù)標(biāo)本中補(bǔ)體不能被全部滅活，過高的孵育溫度還可能導(dǎo)致低濃度弱抗體活性喪失而檢不出。筆者認(rèn)為以往傳統(tǒng)血清加熱滅活補(bǔ)體的方法敏感性低，操作繁瑣，不宜常規(guī)使用。

血型血清學(xué)試驗(yàn)中補(bǔ)體的激活需鈣、鎂離子參加，因此國外用EDTA鉀鹽溶液絡(luò)合鈣、鎂離子，消除溶血的干擾［2，3］。目前該法已常規(guī)用地交叉配血。EDTA不僅防止補(bǔ)體激活，還可以防止高效價(jià)抗-A(B)在ABO反定型時(shí)出現(xiàn)前帶現(xiàn)象(不凝集，即假陰性)［2］。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看EDTA對(duì)血清中的抗體效價(jià)沒有影響，所以EDTA抗凝血適合用于進(jìn)行ABO反定型或交叉配血

綜上所述，建議用于血型和配血試驗(yàn)的標(biāo)本常規(guī)的采用EDTA抗凝管采血。由于條件所限不能用EDTA抗凝者如發(fā)現(xiàn)有因溶血造成的正反定型不符，將血清放56℃滅活補(bǔ)體也可，但要注意溫度和時(shí)間，以免血清中抗體失活。

1 孫愛農(nóng)，鮑自謙，曹鐵源.紅細(xì)胞血型血清學(xué)試驗(yàn)中溶血現(xiàn)象的消除.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2002，17:20.

2 Judd WJ，Steiner EA，O’Donnell DB，et al.Discrepancies in reverse ABO typing due to prozone.How safe is the immediccte-spin crossmatch.Tranfuion，1988，28:334-338.

3 Shulman IA，Calderon C.Effect of delayed centrifugation or reading on the detection of ABC ineompatibility by the immediate-spin crossmatch.Tranfuion，1991，31:197-200.