血小板活化與相關(guān)疾病的研究進(jìn)展

謝曉民 陳晶

血小板由骨髓中成熟巨核細(xì)胞的胞質(zhì)分割而成，是循環(huán)血液中最小的細(xì)胞，又稱血栓細(xì)胞。健康人循環(huán)血液中的血小板形態(tài)、代謝與功能處于未活化狀態(tài)，稱為靜止血小板。當(dāng)血小板受刺激激活或與受損的血管壁、血管外組織接觸時(shí)，外形發(fā)生改變，產(chǎn)生黏附、聚集和釋放反應(yīng)稱為血小板活化。血小板活化在血栓前狀態(tài)、血栓性疾病和腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的診斷、預(yù)防、治療、發(fā)病機(jī)制等方面的研究中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，綜述如下。

1 血小板的結(jié)構(gòu)和生理功能

血小板的表面結(jié)構(gòu)由細(xì)胞外衣和細(xì)胞膜組成，糖蛋白(glycoprotein，Gp)是血小板膜蛋白的主要成分。按Gp在血小板的分布部位不同，將其分為質(zhì)膜和顆粒膜糖蛋白。質(zhì)膜糖蛋白主要存在于靜止血小板細(xì)胞膜表面，其中以GpⅡb/Ⅲa復(fù)合物最多，且為血小板特異抗原。而α顆粒膜蛋白則主要存在于血小板胞質(zhì)內(nèi)的 α 顆粒(α-granule membrane protein，GMP)，顆粒(致密顆粒)和α顆粒(溶酶體)。GMP存在于靜止血小板α顆粒膜上，其分子量為140 KD，故稱為GMP-140。由于它屬于選擇素家族成員，又稱P-選擇素。按人類白細(xì)胞分化抗原(HLDA)的分類原則，P-選擇素被命名為 CD62P［1］，它主要參與活化血小板與白細(xì)胞的黏附。

血小板是一種多功能細(xì)胞，通過(guò)黏附、聚集、釋放功能參與主要涉及血管和血小板的初期止血反應(yīng)，并通過(guò)分泌其顆粒中內(nèi)含的多種因子、提供凝血催化表面和促進(jìn)血塊收縮，促進(jìn)血液凝固。在動(dòng)脈粥樣硬化、炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)等病理生理過(guò)程中，血小板也起著重要作用。

2 血小板活化機(jī)制

循環(huán)中的血小板90%以上是靜寂的，這保證了正常人不會(huì)因血小板過(guò)度活化而引起血栓性疾病。當(dāng)一些激活劑如二磷酸腺苷(ADP)、凝血酶、膠原、腎上腺素、花生四烯酸等與血小板膜上相應(yīng)受體結(jié)合后，可使血小板迅速活化?；罨“迥ぬ堑鞍籽杆俪霈F(xiàn)重新分布、分子結(jié)構(gòu)變化等生化反應(yīng)，導(dǎo)致血小板發(fā)生黏附、聚集，同時(shí)血小板發(fā)生釋放反應(yīng)，變形前藏于血小板膜內(nèi)側(cè)的GpⅡb/Ⅲa暴露于血小板表面;α顆粒受刺激向血小板膜聚攏，通過(guò)血小板開(kāi)放管道系統(tǒng)將β-TG、PF4釋放出來(lái)，同時(shí)將膜上的p選擇素(以CD62p為主)融合在血小板表面外衣上，使血小板表達(dá)p選擇素;溶酶體膜蛋白CD63以同樣的方式轉(zhuǎn)位到血小板膜表面?；罨“迮c靜止血小板比較，膜糖蛋白的種類、結(jié)構(gòu)、功能、含量和分布特點(diǎn)均呈現(xiàn)顯著變化。因此，GpⅡb/Ⅲa、CD62p、CD63均被認(rèn)為是特異性血小板活化分子標(biāo)志物［2］。

3 血小板活化與疾病

活化的血小板形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能、代謝均發(fā)生變化，除引起血栓外，還可促進(jìn)中樞神經(jīng)遞質(zhì)的生成，加速炎癥、水腫、擴(kuò)大梗死面積，參與免疫等反應(yīng)［3］。

3.1 血小板活化與腦梗死 靜止?fàn)顟B(tài)的血小板并不黏附于內(nèi)皮細(xì)胞而聚集。在血管損傷和高切應(yīng)力等病理情況下，血小板受刺激活化，血小板和纖維蛋白聚集成團(tuán)，引起動(dòng)脈血栓形成。

腦梗死最常見(jiàn)的原因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化，而血小板的活化在動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展和血栓形成中起著重要的作用。由于硬化斑塊或潰瘍的形成，損傷了血管內(nèi)皮，使皮下膠原暴露，導(dǎo)致大量血小板被激活，促使血小板在局部發(fā)生黏附、聚集和釋放，產(chǎn)生血栓，堵塞血管，造成梗死。血小板膜糖蛋白在血小板黏附于血管壁及相互聚集、形成血栓的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。GpⅡb/Ⅲa復(fù)合物是纖維蛋白原的受體，參與血小板聚集反應(yīng)，也是血管性血友病因子(vWF)和纖維連接蛋白(Fn)的受體，參與血小板黏附反應(yīng)。在多種血栓性疾病中，血小板活化程度增高并參與疾病的發(fā)生和發(fā)展，其中活化血小板膜糖蛋白發(fā)生顯著變化，特別是血小板活化依賴性顆粒表面膜蛋白 CD63、CD62p等，是血小板活化和釋放反應(yīng)最特異性的標(biāo)志物，可作為體內(nèi)血栓形成標(biāo)志及體內(nèi)定位診斷靶子［4-7］。

CD62p作為最特異性的血小板活化指標(biāo)，在啟動(dòng)和擴(kuò)大血栓形成中具有重要的意義［8，9］。組織缺血后的再灌注損傷產(chǎn)生大量氧自由基、其他內(nèi)皮細(xì)胞和血小板刺激物質(zhì)，釋放凝血酶促使內(nèi)皮細(xì)胞和血小板表達(dá)大量CD62p，血小板CD62p具有介導(dǎo)活化的血小板或內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞黏附的功能，導(dǎo)致組織因子暴露，凝血系統(tǒng)活化反過(guò)來(lái)又進(jìn)一步活化血小板，形成惡性循環(huán)［10］。

3.2 血小板活化與冠心病 冠心病的發(fā)病與多種因素有關(guān)，目前認(rèn)為其發(fā)生和發(fā)展與血小板活化有著密切的關(guān)系［11］。在血栓形成的過(guò)程中，血小板的激活是一個(gè)重要因素。粥樣硬化斑塊使冠狀動(dòng)脈血管破損，通過(guò)多種途徑激活血小板，導(dǎo)致血小板黏附聚集，形成富含血小板的血栓，使冠狀動(dòng)脈完全或部分堵塞，冠狀動(dòng)脈血流受限，可能引起心肌缺血，促成冠心病的發(fā)生和發(fā)展。

血小板膜糖蛋白GPIb與內(nèi)皮下表層的vWF、Fn等黏附蛋白的相互結(jié)合及作用始動(dòng)血小板活化過(guò)程，同時(shí)釋放血栓烷A2(TXA2)、血管活性物質(zhì)等，生成促凝酶。ADP、TXA2和促凝酶進(jìn)一步介導(dǎo)循環(huán)血小板與內(nèi)皮下表面黏附著的血小板相互作用，加重血小板聚集反應(yīng)，收縮冠狀動(dòng)脈，加重血管阻塞及心肌缺血缺氧，其中內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)被激活以及凝血酶的形成，加速了血小板聚集和纖維蛋白原向纖維蛋白的轉(zhuǎn)化，對(duì)血栓形成起到生物放大作用。而GpⅡb/Ⅲa作為受體，與多種循環(huán)中的蛋白，如血漿黏附蛋白，纖維蛋白原肌纖維連接蛋白結(jié)合而聚集。在冠心病中，血小板形態(tài)變化為血小板偽足形成增多，血小板黏附性和血小板對(duì)各種聚集誘導(dǎo)劑(ADP、腎上腺素、膠原或花生四烯酸)的聚集反應(yīng)增強(qiáng)，血漿中血小板釋放產(chǎn)物［ADP、TXA2、5-羥色胺(5-HT)、β-血小板球蛋(β-TG)等］濃度升高，血小板α顆粒膜蛋白CD62p在血小板表面及血漿中的濃度增強(qiáng)，這充分說(shuō)明血小板活化是血栓形成的重要病理機(jī)制之一。另外，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊導(dǎo)致管腔狹窄及產(chǎn)生紊亂，病灶組織的促血小板黏附特征有利于血小板栓子形成，而在血小板栓子形成過(guò)程中，所釋放的TXA2會(huì)引起血管痙攣，與栓塞共同構(gòu)成猝死的原因［12］。

3.3 血小板活化與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE) SLE是一種自身免疫性結(jié)締組織病，由于體內(nèi)有大量致病性自身抗體和免疫復(fù)合物，造成組織所傷，臨床可以出現(xiàn)各個(gè)系統(tǒng)和臟器損害的癥狀。有研究表明，SLE患者外周血CD62p和CD63表達(dá)量明顯高于健康人［13，14］。這與SLE患者體內(nèi)的免疫復(fù)合物沉積于關(guān)節(jié)、小血管內(nèi)膜或腎小球基底膜(GBM)等部位，激活補(bǔ)體引起炎性反應(yīng)有關(guān)。狼瘡腎炎患者體內(nèi)血小板和血管內(nèi)皮處于高度激活狀態(tài)，分泌或表達(dá)的CD62p和CD63增多，并可能介導(dǎo)血小板及其與之相互作用的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞核T淋巴細(xì)胞等，分泌大量的正電荷和炎性蛋白，中和了GBM固定的負(fù)電荷;或分泌炎性蛋白對(duì)GBM的負(fù)電荷物質(zhì)產(chǎn)生酶性降解作用;或分泌的炎性蛋白引起腎內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)改變。通過(guò)檢測(cè)血小板活化功能，還可判斷SLE患者的病情輕重。

3.4 血小板活化與惡性腫瘤 臨床研究表明血栓形成是目前癌癥患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥和第二大死亡原因［15］。惡性腫瘤與止凝血功能的改變有著密切的關(guān)系。CD62p介導(dǎo)血小板與腫瘤細(xì)胞的黏附主要是通過(guò)其氨基末端凝集素樣區(qū)域在Ca2+存在的條件下識(shí)別并結(jié)合CD62p配體而得以實(shí)現(xiàn)。CD62p配體都是一些寡糖基團(tuán)，具有唾液酸化的氨基多糖結(jié)構(gòu)或類似結(jié)構(gòu)，存在于多種糖蛋白和糖脂分子上，分布于多種體細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞表面。主要有s-lewis x，s-lewis a和CD24等。

腫瘤細(xì)胞表面可表達(dá)大量s-lewis x和s-lewis a，這類寡糖可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的直接接觸。一方面，腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如白介素、腫瘤壞死因子、血管通透因子等可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其活化并表達(dá)CD62p［16］;另一方面，許多上皮性腫瘤可分泌粘蛋白及s-lewis x和s-lewis a抗原，后者正是CD62p的配體，活化的內(nèi)皮細(xì)胞可識(shí)別它，并通過(guò)它與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞穿過(guò)血管壁。

CD62p還可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血小板的結(jié)合。已證實(shí)腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)與癌栓存在與否具有很大相關(guān)性。血小板與血循環(huán)中的癌細(xì)胞結(jié)合形成“微小癌栓”，微小血栓與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，停留在遠(yuǎn)離器官血管中，穿出血管壁形成轉(zhuǎn)移灶［17］。

4 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)在檢測(cè)血小板活化中的應(yīng)用

血小板的數(shù)量與功能是臨床血栓與止血檢查和研究的重要內(nèi)容。FCM分析血小板是臨床血小板分析方法學(xué)與應(yīng)用的重大發(fā)展，它開(kāi)創(chuàng)了對(duì)單個(gè)血小板或血小板亞群分析的嶄新途徑。血液中的血小板體積小，與紅細(xì)胞、白細(xì)胞混懸于血漿中，且極易受環(huán)境因素影響(包括各種刺激劑、受損的血管壁、剪切應(yīng)力、異物表面等)而發(fā)生變形、黏附、聚集、釋放和收縮反應(yīng)，使血小板分析的難度增大，尤其是對(duì)體內(nèi)循環(huán)血小板活化與功能的研究影響較大，因而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法很難得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于FCM的迅速發(fā)展和各種血小板特異性單克隆抗體的制備成功并可以直接標(biāo)記熒光素分子，使得近年來(lái)FCM分析血小板逐漸從研究開(kāi)始過(guò)渡到臨床應(yīng)用。

與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法相比，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析血小板活化具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)可以在全血中、更接近生理環(huán)境下(包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞，這兩種細(xì)胞都可能影響血小板的活化)直接測(cè)定血小板活化。(2)最少的標(biāo)本處理，避免了體外人為所致的血小板活化和血小板亞群的丟失。(3)既能測(cè)定循環(huán)血小板的活化狀態(tài)，又可以檢查循環(huán)血小板的反應(yīng)性。(4)可以測(cè)定血小板特異性活化依賴的膜表面多種受體的變化。(5)一些新的單克隆抗體，直接抗血小板某些新的功能性抗原決定簇的抗體，可以很容易用于檢測(cè)。(6)FCM具有極高的靈敏度，可以在全血中檢出僅有1%、部分被活化的血小板亞群。(7)FCM分析血小板活化無(wú)放射性污染，主觀因素較少，分析準(zhǔn)確。

總之，血小板活化與多種疾病相關(guān)，其活化程度可由血小板膜糖蛋白表達(dá)水平的高低來(lái)判斷，而應(yīng)用FCM測(cè)定血小板膜糖蛋白的表達(dá)情況已成為檢查血小板功能的一種新手段，對(duì)血小板活化相關(guān)疾病的診斷、治療、監(jiān)測(cè)有著極其重要的作用。

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